UPLC 法测定乳及乳制品中乳清蛋白的研究

刘利娟

（鹤壁职业技术学院，河南鹤壁 458030）

母乳是婴儿生长发育最理想的食物，牛乳因营养成分与母乳十分接近，越来越成为人们不可或缺的食物。牛乳中蛋白质主要由乳清蛋白和酪蛋白两大类蛋白质构成[1]，其中，酪蛋白占牛乳总蛋白质含量约80%，乳清蛋白占牛乳总蛋白量约20%，通常通过调节牛乳pH 为4.6 时，利用蛋白质等电点沉淀原理，将乳清蛋白与酪蛋白分离，上清液即为乳清蛋白[2]。乳清蛋白含有多种活性物质，包含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等[3]，能够为人体提供优质蛋白和活性肽。α-乳白蛋白可以有效的防止癌变，具有抗肿瘤的效果；它还可与钙相结合，是钙主要补充剂，可以促进儿童的钙吸收以及防止老年人出现骨质疏松的症状；同时，含高浓度胱氨酸和色氨酸，易于婴幼儿消化吸收，所以，婴幼儿配方奶粉中通常添加α-乳白蛋白，使营养成分更加接近母乳[4]。β-乳球蛋白能够与脂肪酸和脂溶性维生素相结合，同时还能够加快其在机体内吸收的速度。乳铁蛋白被视为红蛋白，它是可以结合铁的功能性糖蛋白，含有氨基和羧基，能够与铁可逆结合从而促进铁吸收；乳铁蛋白能够调节人体铁质转移，可以促进婴儿骨骼的生长发育。

高效液相色谱法（HPLC）作为测定食品中蛋白质含量的方法已基本成熟且工业应用范围较广，但这种方法操作十分繁杂，需要人工手动进样，且耗时较长；超高效液相色谱（UPLC）色谱柱更短，装填的填料粒径更小[5]，常见的为1.7 μm，较小的粒径使得该色谱柱与常规高效液相色谱柱（HPLC）比，具有单位长度内更高的塔板数，从而使样品达到更好的分离。高流速的使用加速了分析的速度，同时也提高了分辨率和灵敏度，因此，本研究意在缩短洗脱时间，与高效液相色谱法相比实现在更短的时间里对乳及乳制品中乳清蛋白的快速检测。

1 实验材料与仪器

α-乳白蛋白（德国sigma 公司，纯度≥85%）、β-乳球蛋白（德国sigma 公司，纯度≥90%）、乳铁蛋白（德国sigma 公司，纯度≥95%）、乙腈（can，色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司）、三氟乙酸（TFA，色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司）、鲜牛乳、婴幼儿配方奶粉。

PB-10 型pH 计（赛多利斯科学仪器有限公司）、抽滤装置（北京卓信伟业科技有限公司）、sigma3K-15 型高速冷冻离心机（德国sigma 公司）、超高效液相色谱（上海沃特世科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 UPLC 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH300 Å C18 色谱柱，柱温38℃；流动相A 为0.1%TFA/H2O，流动相B 为乙腈+三氟乙酸（1 000:0.5）；进样量为10 μL；流速为0.5 mL/min；波长为280 nm，分离度4.8 nm。

2.2 样品前处理

牛乳样品：取50 mL 鲜牛乳样品，于20℃温度下，10 000 r/min 离心20 min，过滤去除脂肪，清液于-20℃保存，备用。取5 mL 的清液，用1 mol/L 的醋酸缓冲液调节pH 至4.6，放置室温沉淀1 h，然后以10 000 r/min 离心10 min，用移液枪吸取上清液（上下层沉淀为酪蛋白），清液再以10 000 r/min离心，去除杂质，0.22 μm 的尼龙膜过滤后上机检测[5]。

奶粉样品：称取婴儿奶粉100 g，定容至1 000 mL 混匀，制备成均一稳定的复原乳。取50 mL 复原乳样品，于20℃温度下，10 000 r/min 离心20 min，过滤去除脂肪，清液于-20℃保存，备用。上机前处理方法同牛乳样品。

2.3 标准品溶液的配制

分别精确称取α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白标准品20 mg、20 mg 和25 mg 用超纯水溶解定容至10 mL，即得母液浓度为2 mg/mL、2 mg/mL 和2.5 mg/mL，将母液保存至-20℃，备用。

3 结果与讨论

3.1 色谱柱及检测波长的选择

色谱柱通常根据填料的细孔直径和键合的烷基链长度的不同分为C4、C8、C18，C4 常用来分离较大分子量的蛋白，而C8、C18 用来分离中等大小的蛋白，通过多次实验，发现C18色谱柱对于样品的保留峰型较好，故本实验选用C18 来分离乳清蛋白，并且分别选用了ACQUITY UPLC BEH 色谱柱粒径为300 Å 和150 Å 进行比较，实验表明粒径为300 Å 的色谱柱对样品的保留值较高。

检测波长的选择中，实验分别在220 nm、250 nm、280 nm处都有吸收峰，250 nm 和280 nm 处杂峰均较少，但是标准品在250 nm 处出现杂峰，容易对样品的检测产生干扰，且峰形不够尖锐。而在280 nm 处，响应值最高，灵敏度也最高，故实验方法最终选择280 nm 的波长。

3.2 洗脱条件的选择

本实验共选择多种洗脱条件，最终选择出较好的洗脱梯度，整个洗脱时间为9 min，流速为0.5 mL/min，0 min～3 min 洗脱相A 由61%～59%，3 min～5 min洗脱相A由59%～54%，5 min～7 min 洗脱相A 由54%～15%，7 min～9min 洗脱相A 由15%～61%。在这种条件下混标得到了基本的分离，且样品在此条件下分离度也十分良好，实现了更快速的检测。具体分离情况如图1、图2 所示。

图1 经优化后的乳清蛋白标准品色谱图

图2 经优化后的奶粉样品色谱图

图1 为乳清蛋白标准品色谱图，三种蛋白质能够在4 min内实现完全分离，且分离度较好，说明该洗脱条件比较好，由图2 根据出峰时间可以确定出α-乳白蛋白、β-乳球蛋白，可以看出奶粉样品中没有检测出乳铁蛋白，分析原因有两个，一是这批奶粉中的乳铁蛋白含量很低，含量已经低至色谱仪的检出限以下；二是由于超高效液相色谱的检测速度太快，分离度不好，导致乳铁蛋白未检测出。

3.3 标准曲线的绘制

将α-乳白蛋白标准品母液分别稀释成0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL；β-乳球蛋白标准品母液稀释为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL；乳铁蛋白标准品母液稀释为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL。按照上述2.1 小节的色谱条件、3.2 小节的洗脱条件对标准乳清蛋白进行测定，采用外标法绘制曲线，求得α-乳白蛋白回归方程为y=1 158 781.813 4x-37 443.707 8，线性范围为0.5 mg/mL～4 mg/mL，检出限为0.005 mg/mL；β-乳球蛋白回归方程为y=2 147 168.176 5x+288 433.480 4，线性范围为0.125 mg/mL～2 mg/mL，检出限为0.002 mg/mL；乳铁蛋白回归方程为y=1 088 688.819 7x+33 176.763 7，线性范围为0.25 mg/mL～4 mg/mL，检出限为0.005 mg/mL；三种标准蛋白质的回归方程相关系数均大于0.999 4，线性回归性良好。

3.4 精密度实验

在2.2 小节的样品前处理的条件下处理样品，根据3.2 小节的洗脱条件进样10 μL，每个样品连续进样5 次，求得样品中各乳清蛋白的含量，并求得平均值及标准偏差。

如表1 所示，α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白检测的RSD 值均小于2%，满足实验的要求，实验的精密度良好。婴儿奶粉中的α-乳白蛋白含量明显高于牛乳，且含量同婴幼儿奶粉中的配方含量一致。但β-乳球蛋白的含量相对较低，这是由于奶粉在加工过程中损失掉一部分蛋白，且该奶粉中没有特别添加β-乳球蛋白。牛乳中测得的乳铁蛋白含量较低，可能是由于品种、批次和季节的原因导致含量偏低，奶粉中含量已低至检出限以下，证实该婴幼儿配方奶粉没有特别添加乳铁蛋白或者添加量较少，不符合生产要求。

表1 精密度实验（n=5）

3.5 加标回收率实验

平行称取牛乳样品和奶粉样品各3 份，分别加入不同量的标准品，同时按照2.2 小节的样品前处理方法、2.1 小节的色谱条件、3.2 小节的洗脱条件，上机检测，求得样品的回收率和RSD 值。

如表2 所示，牛乳和奶粉中的回收率均在91.31%～103.49%之间，测得α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白的RSD 值分别为0.696%、2.494%、4.699%、4.851%和3.872%，均小于5%，说明该方法的前处理优化条件良好，实验重现性良好，实验可靠。

表2 加标回收率(n=3)

4 结论

本研究采用超高效液相色谱，使用ACQUITY UPLC BEH300 Å C18 色谱柱测定乳清蛋白含量，以0.1%TFA/H2O，乙腈+三氟乙酸（1 000:0.5）为流动相，流速为0.5 mL/min，进行梯度洗脱，在280 nm 波长下检测。通过多次优化前处理方法、流动相洗脱程序，在9 分钟内实现了完全分离，具有操作简单、无需人工操作、可实现连续进样、分离时间短等优点。该方法的精密度实验的RSD 值均在5%以下，实验的重复性良好，鲜牛乳和婴幼儿奶粉的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白的加标回收率均在91.31%～103.49%之间，回收率较高，方法可靠准确，该方法的建立为企业提供了更快速、更微量的测定乳清蛋白的方法。