基于ANP32 蛋白的B 型流感病毒聚合酶的纯化及其单克隆抗体的高效制备

纪玉洁，郭 兴，张振宇，王晓钧

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队，黑龙江 哈尔滨 150069）

B 型流感病毒（Influenza B virus，IBV）属正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属，是有囊膜、分节段的负链RNA 病毒。IBV 感染宿主引起的呼吸系统症状通常较轻，儿童和老人较易感，可引发多种并发症，影响肌肉、心脏和神经系统等[1]。IBV 无亚型区分，根据病毒表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）的抗原性差异可分为Victoria 和Yamagata两个谱系[2-3]。病毒核糖核蛋白体复合物（Viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）作为病毒复制的最小单元，由RNA 依赖性RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）、核糖核蛋白（Nucleoprotein，NP）以及病毒RNA（Viral RNA，vRNA）组成，对病毒在宿主细胞内的有效复制至关重要，vRNP 在复制过程中相对保守，变异率低，是影响流感病毒宿主适应性的关键因素[4-5]。

RdRp 作为一种异源三聚体复合物，目前仍无一种快速、高效的纯化策略，同时也缺乏IBV RdRp 各亚基单克隆抗体（MAb）制备的相关报道。近期研究发现流感病毒宿主蛋白—ANP32 家族蛋白（酸性核磷酸蛋白32，主要包括ANP32A、ANP32B、ANP32E等）能够与流感病毒RdRp 高效结合并支持流感病毒在宿主细胞内的复制，其羧基端结构域对这一高效结合发挥了重要作用[6-7]。本研究以此为理论基础，利用表达融合有flag 标签的鼠ANP32B 羧基末端结构域[muANP32B（111-C）-flag]的质粒与表达IBV RdRp各亚基（PB1、PB2、PA）的质粒，以免疫沉淀（IP）的方法纯化IBV RdRp，将获得的ANP32B（111-C）-RdRp 复合物作为免疫原免疫BALB/c 小鼠，经间接ELISA 分别筛选出针对IBV PB1、PB2、PA 亚基及ANP32B（111-C）蛋白的MAb，并对获得的4 株MAb的生物学特性进行了初步分析。为深入探究IBV RdRp 与宿主细胞的相互作用奠定实验基础，同时也提供了一种异源多聚体复合物纯化及快速制备其各亚基MAb 的有效方法。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGSIBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA、pCAGGS-IBVYmPJ18NP、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-NP-His、pCAGGS-IBVVictoriaPB1-His、pCAGGSIBVVictoriaPB2-His、pCAGGS-IBVVictoriaPA-His、融合有His 标签的表达A、C、D 型流感病毒RdRp 各亚基的质粒、融合有flag 标签的鼠、人、鸡、牛、马、猪、犬等物种表达ANP32 蛋白（包括ANP32A、ANP32B 及ANP32E）的质粒、pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag、pCAGGS-flag 等质粒及293T 细胞、SP2/0 细胞、MDCK 细胞、ANP32 基因双敲除细胞（ANP32A/ANP32B double-knockout cells，DKO）由本实验室构建或保存；IBV（B/Yamagata/PanJin/2018株，简写为IBVYmPJ18，后续实验若未特别说明均是指该株病毒）由本实验分离并保存；6 周龄SPF 级BALB/c 雌性小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司；抗-flag M2 磁珠、融合剂PEG、HT Supplement（50×）、HAT Supplement（50×）、flag MAb、6×Histag MAb、HRP 标记的羊抗鼠IgG（IgG-HRP）、Dy-Light 800TM标记的羊抗鼠IgG、3×flag 多肽、TPCK 胰酶均购自Sigma 公司；96 孔聚乙烯酶标板购自Costar公司；蛋白Marker 均购自Thermo Fisher 公司；TMB显色液、QuickAntibody-Mouse 3W（3 周标准鼠MAb/多克隆抗体制备佐剂）购自北京博奥龙免疫技术有限公司；HiTrap Protein G HP 抗体纯化试剂盒购自GE Healthcare 公司；商品化IBV NP 蛋白多克隆抗体购自Gene Tex 公司；PolyJetTMin VitroDNA transfection reagent 购自SignaGen 公司；Alexa Fluor488 山羊抗小鼠IgG 购自Invitrogen 公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Millipore 公司。

1.2 IBV ANP32B（111-C）-RdRp复合物表达与纯化的IP 试验待DKO 细胞密度约80%时，利用PolyJet试剂将pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA 和pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 等质粒共转染至该细胞，并设置表达人ANP32B蛋白的质粒、表达小鼠muANP32B的质粒分别替换上述试验中的pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 作为阳性对照。8 h 后更换细胞培养液，36 h 后裂解细胞，12 000 r/min 离心10 min 后取上清，加入抗-flag M2磁珠，4 ℃旋转摇床孵育2 h 后取出，PBS 充分洗涤后，加入3×flag 多肽，4 ℃旋转摇床洗脱1 h 后收获目的蛋白，经SDS-PAGE 分析目的条带的大小及表达量。

1.3 MAb 的制备将1.2 IP 试验得到的IBV ANP32B（111-C）-RdRp 和QuickAntibody-Mouse 3W 快速佐剂等体积混匀，以颈背部皮下多点注射（20 μg/只）的方式免疫BALB/c 雌性小鼠，以上述方法每隔两周进行第2 次和第3 次免疫。第2 次免疫后尾静脉采血，通过间接ELISA 方法[8]检测血清效价，当血清效价达到1∶12 800 以上时，注射上述复合物（100 μg/只）加强免疫。加强免疫3 d 后，将小鼠脾细胞与SP2/0 细胞在PEG 作用下融合。融合后培养至第10 d，利用上述间接ELISA 方法检测抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并通过有限稀释法经过3 次克隆纯化，直至筛选出能够稳定分泌IBV RdRp 特异性MAb 的阳性杂交瘤细胞株。

利用PolyJet 分别将质粒pCAGGS-IBVYmPJ18PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18PAHis、pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 转染DKO 细胞。24 h 后裂解细胞，取上清经SDS-PAGE 电泳后转膜，以杂交瘤细胞培养上清为一抗，以DyLight 800TM标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，利用western blot 分别鉴定各阳性杂交瘤细胞株分泌MAb 所结合的RdRp亚基及与mANP32B（111-C）的反应性。

从获得的4 种类型的MAb 中各选取效价最高的1 株，将其杂交瘤细胞经腹腔注射经产BALB/c 小鼠（经弗氏不完全佐剂预处理），约1.0×107个细胞/只，7 d～10 d 后采集腹水，小鼠腹水样品经离心过滤后，利用亲和层析柱纯化，-80 ℃保存。

1.4 MAb 效价的测定将纯化后的各腹水用PBS（pH7.4）自1∶2 000 开始，2 倍倍比稀释至1∶1.024×106并作为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）为二抗，经间接ELISA（以20μg/板的剂量包被纯化的IBV RdRp 蛋白）测定MAb 的效价。

1.5 MAb 交叉反应性的鉴定将293T 细胞铺于六孔板中，并根据转染质粒的种类将其分为A、B、C共3 组，待细胞密度为70%～80%时分别用PolyJetTM转染。A 组每孔分别转染表达A 型流感病毒（Influenza A virus，A/Sichuan/01/2009 株：IAVSC09）、IBV（IBVVictoria和IBVYamagata）、C 型流感病毒（Influenza C virus，C/Victoria/02/2012 株：ICVVictoria）、D 型流感病毒（Influenza D virus， D/bovine/Yamagata/10710/2016株：IDVYamagata）RdRp 的PB1 单亚基蛋白的质粒各1 μg；B 组和C 组分别转染上述病毒株中表达PB2、PA 单亚基蛋白的质粒；将DKO 细胞铺于六孔板中并设置为D 组，每孔分别转染融合有flag 标签的鼠、人、鸡、牛、马、猪、犬等物种表达的ANP32蛋白（包括ANP32A、ANP32B 及ANP32E）的质粒各1 μg，并以转染pCAGGS-flag 质粒作为阴性对照。8 h后换液，继续培养至24 h 后裂解细胞，12 000 r/min离心10 min 后取上清，以各组对应的小鼠纯化腹水（1∶1 000）为一抗，以DyLight 800TM标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000）为二抗，采用western blot 分析制备的各亚基MAb 分别与A、B、C、组表达的各病毒RdRp 各亚基的交叉反应性，及制备的ANP32 蛋白MAb 与各物种表达的ANP32 蛋白的反应性。

1.6 利用MAb 对IBV 感染的MDCK 细胞及鼠源细胞中天然靶蛋白定位的激光共聚焦试验将MDCK细胞传代至4 个细胞培养皿中，待细胞生长至密度50%左右，将实验室保存的IBV 分别接种至上述4 个细胞培养皿中。2 h 后换液，继续培养至48 h；将SP2/0 细胞培养至密度约50%；将293T 细胞分别传代至4个细胞培养皿中，待细胞生长至70%～80%，分别转染pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-NP-His；将DKO 细胞传代至1 个细胞培养皿中，待细胞生长至70%～80%，转染pCAGGS-mu-ANP32B-flag，继续培养24 h，作为上述试验的阳性对照。

将上述细胞分别用4%多聚甲醛固定30 min，0.05% Triton X-100 通透15 min， 5% 脱脂乳封闭1 h后，实验组中4 个接种IBV 的MDCK 细胞分别以IBV NP 蛋白多克隆抗体（1∶200）、本实验制备的PB1 MAb（1∶500）、PB2 MAb（1∶500）和PA MAb（1∶500）为一抗；SP2/0 细胞以muANP32B MAb 6C7（1∶500）为一抗；转染pCAGGS-IBVYmPJ18-PB1-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PB2-His、pCAGGS-IBVYmPJ18-PA-His、pCAGGSIBVYmPJ18-NP-His 的293T 细胞分别以6×His-tag MAb（1∶500）作为一抗；转染pCAGGS-muANP32B-flag 的DKO 细胞以flag MAb（1∶200）作为一抗。所有细胞培均以Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG（1∶200）作为二抗，室温避光孵育1 h，DAPI 染核10 min 后，利用高分辨率活细胞共聚焦显微镜观察IBV 感染宿主细胞后RdRp 各亚基及muANP32B 的定位情况。

2 结 果

2.1 IBV APN32（111-C）-RdRp 复合物的表达及纯化将质粒pCAGGS-IBVYmPJ18PB1、pCAGGS-IBVYmPJ18PB2、pCAGGS-IBVYmPJ18PA 和pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 共转染DKO 细胞，将表达鼠和人ANP32B 蛋白的质粒分别替换pCAGGS-muANP32B（111-C）-flag 作为两个阳性对照组，36 h 后裂解细胞，离心后取上清，经IP 试验纯化后经SDS-PAGE 检测。结果显示，实验组[形成了（ANP32B（111-C）- RdRp（PB1-PB2-PA）复合物，简写为ANP32B（111-C）-RdRp]和阳性对照组经IP 纯化后均在约80 ku 处有单一目的条带，分子量大小均与预期一致（图1），表明鼠源muANP32B 羧基末端结构域[muANP32B（111-C）-flag]确实能够特异性结合RdRp，且获得了纯度较高的ANP32B（111-C）-RdRp 复合物，可以用于后续试验。

图1 ANP32B（111-C）-RdRp表达及纯化的SDS-PAGE检测结果Fig.1 Detection of the expression and purification of ANP32B(111-C)-RdRp by SDS-PAGE

2.2 MAb 的筛选与鉴定结果将IP 试验得到的ANP32B（111-C）-RdRp 复合物免疫BALB/c 雌性小鼠，并经间接ELISA方法筛选。结果显示，筛选出27株阳性杂交瘤细胞。利用western blot鉴定MAb所靶向的蛋白，结果显示，共获得4 类MAb，即获得了稳定分泌PB1 亚基、PB2 亚基、PA 亚基、muANP32B（111-C）MAb的杂交瘤细胞各3株、2株、17株和5株。

2.3 MAb 效价的检测结果根据间接ELISA 和western blot 结果，在以上4类杂交瘤细胞株中分别取上清效价最高者，经有限稀释法3 次克隆纯化并诱导小鼠产生腹水，利用间接ELISA 方法检测其效价。结果显示，纯化后获得的PB1、PB2、PA、muANP32B（111-C）MAb 效价分别为1∶2.56×105（1D10）、1∶5.12×105（1E9）、1∶1.28×105（2E9）、1∶6.4×104（6C7）。以上数据表明本实验获得的4 类MAb 的效价均较高。

2.4 MAb 交叉反应性的鉴定结果获得的靶向IBV RdRp 亚基PB1、PB2、PA 的MAb 分别与不同流感病毒（A、B、C、D 型）RdRp 各亚基蛋白反应后经western blot 鉴定。结果显示，本研究制备的IBV RdRp各单亚基MAb 均能够与IBVVictoria株和IBVYamagata株RdRp对应的单亚基蛋白（PB1、PB2、PA）结合，分别在83 ku、85 ku、81 ku 处出现特异性条带，但与A、C、D 型流感病毒RdRp 对应单亚基均不结合，在相应位置处无目的条带（图2A～图2C）。本研究制备的muANP32B（111-C）MAb 对鼠、鸡、牛、猪、犬的ANP32B 蛋白以及鸡的ANP32A 蛋白识别能力较强，相应条带颜色较深，而与马的ANP32 蛋白均不反应。转染pCAGGS-flag质粒的阴性对照组无该条带（图2D～图2E），表明本实验制备的IBV RdRp 亚基PB1、PB2、PA 的MAb 对各IBV 的识别特异性较强，且ANP32B（111-C）蛋白MAb的物种广谱性较好。

图2 MAb交叉反应性的western blot鉴定结果Fig.2 Cross reactivity test results identified by western blot

2.5 利用MAb 对IBV 感染的MDCK 细胞及鼠源细胞中天然靶蛋白定位的激光共聚焦试验结果将IBV 分别接种至4 个细胞密度约为50%的MDCK 细胞后继续培养48 h；同时以分别转染表达IBV NP、PB1、PB2 及PA 蛋白的质粒并培养24 h 的293T 细胞作为阳性对照。上述细胞分别加入相应的一抗和二抗后，利用激光共聚焦试验分析制备的各MAb 与其各天然靶蛋白之间的反应性并对后者进行亚细胞定位。结果显示，以IBV NP MAb 为一抗的MDCK 细胞及转染IBV NP 蛋白质粒的阳性对照293T 细胞均出现红色荧光（图3A～图3B），表明MDCK 细胞已被IBV感染及293T 细胞中IBV NP 蛋白获得了表达。在该前提下，分别孵育PB2 MAb 1D10、PB1 MAb 1E9、PA MAb 2E9 的MDCK 细胞均出现较强的荧光信号，前者荧光信号在细胞核内较强，后两者在细胞质中的荧光信号相对较强。阳性对照组中，转染表达IBV PB2 蛋白质粒的细胞出现红色荧光，且荧光集中在细胞核内。同样的，转染表达PB1、PA 的293T 细胞均出现红色荧光，且荧光信号集中在细胞质中（图3A～图3B）；将SP2/0 细胞培养至密度约为50%，同时将CAGGS-muANP32B-flag 转染至DKO 细胞中作为阳性对照， 24 h 后分别孵育相应抗体后经激光共聚焦显微镜观察，结果显示，SP2/0 细胞与阳性对照细胞均出现红色荧光，且荧光主要集中在细胞质（图3C～图3D）。上述结果表明，本研究制备的分别靶向IBV RdRp 各单亚基的MAb，均能够在感染IBV的MDCK 细胞中检测到病毒表达的对应天然靶蛋白。其中PB2 亚基主要定位于细胞核内，而PB1 和PA 亚基在胞质中较多，胞核内较少，且各亚基在MDCK 细胞内的定位与对应单亚基蛋白表达质粒转染的各293T 细胞阳性对照组一致。本研究制备的MAb 6C7 能够检测SP2/0 细胞（鼠源细胞）内源性的muANP32B 蛋白，其主要定位在细胞质中，与对应转染表达muANP32B 质粒的DKO 细胞阳性对照组一致。本研究所制备的3 种针对RdRp 亚基的MAb 均能够与其对应天然靶蛋白结合，可用于指示IBV RdRp各亚基在病毒感染过程中在细胞内的定位情况。

图3 MAb与其靶蛋白亚细胞定位的激光共聚焦试验结果Fig.3 Subcellular co-localization of MAbs and their target proteins in vivo under confocal microscopy

3 讨 论

IBV 常在全球范围内与IAV 共流行，在流感局部暴发或季节性流行中占比很高，严重威胁公众健康[3,9]。近年来，IBV 在我国很多地方成为季节性流感的优势病毒，对儿童及青少年的致死率已经高于IAV[10]。vRNP 作为流感病毒最小的复制单元，对病毒在宿主细胞内的生存发挥重要作用。大量研究表明，vRNP 中RdRp 的表观遗传学修饰及其与宿主蛋白的相互作用是维持其正常功能的必要条件[6-7]。同时，快速、高效的聚合酶表达纯化技术是聚合酶功能分析的基础，但由于其异源三聚体的复杂性，致使流感病毒聚合酶纯化的各种工艺均存在一定缺陷。有研究人员通过在聚合酶PB2 亚基引入TAP 标签对其进行纯化。然而，单纯的标签纯化策略不但在一定程度上影响了聚合酶活性，也无法在纯化产物中去除未组装成复合物的PB2 单亚基[11-13]。本研究室前期采用在293T 细胞中表达IBV 聚合酶单亚基PB1-HA、PB2、PA-flag蛋白，并以双标签2步法的策略对聚合酶复合物进行纯化，发现该方法虽然能够去除多余的单亚基，但由于必须纯化2 次导致目的蛋白产量很低，影响最终的纯化效率。

研究表明，ANP32家族蛋白的ANP32A、ANP32B、ANP32E 可通过与流感病毒聚合酶的相互作用维持其在宿主细胞内的正常功能。该类相互作用主要发生在ANP32 蛋白羧基末端的结构域，且仅发生在ANP32 蛋白与流感病毒聚合酶复合物之间，而ANP32 蛋白与流感病毒聚合酶各单体之间不发生相互作用[14]。近期，张振宇等人的研究发现人ANP32A与IBV RdRp 的亲和力高达0.05418 μmol/L[7]。基于此，本实验利用ANP32 蛋白与流感病毒RdRp 之间的高亲和力，将muANP32B（111-C）-flag 作为诱饵蛋白，利用IP 技术富集RdRp，从而得到了纯度较高的IBV ANP32-RdRp 复合物。该纯化策略不但节约时间成本，所获得的RdRp 各亚基均不含标签蛋白，也不影响聚合酶的空间结构，相对提高了小鼠对聚合酶复合物的免疫应答能力，将该复合物免疫小鼠并通过间接ELISA 方法筛选，一次性即获得了多株可识别IBV RdRp 不同亚基的MAb，并通过激光共聚焦技术利用这些MAb 对IBV 感染MDCK 细胞后的RdRp 各亚基的亚细胞定位情况进行了检测。结果显示，所有MAb 均较好地检测出RdRp 各亚基在受感染细胞中的定位情况，其中PB2 亚基主要定位于细胞核内，而PB1 和PA 亚基则在胞质中较多，核内较少，这可能与PB2 亚基单独入核，而PB1 和PA亚基需要在胞质内形成二聚体后才能入核有关。

综上所述，本研究建立了一种高效的IBV RdRp纯化及其各单亚基MAb 的制备策略，并得到了IBV RdRp 单亚基PB1、PB2、PA 以鼠源ANP32B（111-C）的MAb，为该病毒RdRp 的相关研究及其应用提供了有效的技术支持和物质基础。