超高效液相色谱-质谱联用法测定虫草素和腺苷

【摘要】 为扩大检测范围，满足痕量虫草素和腺苷含量的检测，建立超高效液相色谱-质谱联用法测定蛹虫草制品中虫草素和腺苷的含量，同时对其进行测定低限及回收率的验证，结果表明其线性范围0.01 µg·L-1～5 µg·L-1的相关系数均能达到0.9995以上，虫草素和腺苷的测定低限均为0.05 µg·L-1，并具有特异性显著，灵敏度较高等特点。

【关键词】 蛹虫草;超高效液相色谱-质谱联用法;虫草素;腺苷

【DOI编码】 10.3969/j.issn.1674-4977.2022.01.029

Determination of Cordycepin and Adenosine by Ultra High Performance Liquid Chromatography-mass Spectrometry

WANG Guan-yu

（Fushun Food Inspection and Testing Center，Fushun 113000，China）

Abstract： To expand detection range，in order to meet the needs of the less cordycepin and adenosine testing，the UPLC-MS/MS method was established for the determination of cordycepin and， adenosine in Cordyceps militaris products. The determination limit and recovery rate of cordycepin， adenosine and cordycepin in cordyceps militaris were verified simultaneously. The results showed that their linear ranges of 0.01 μg·L-1～5 μg·L-1 were above 0.9995，The limit of detection lower was 0.05 µg·L-1. It has the characteristics and high sensitivity.

Key words： Cordyceps;UPLC-MS/MS;cordycepin;adenosine

蛹蟲草又称北冬虫夏草，与冬虫夏草具有相似的生物活性成分，主要包括虫草素、腺苷、虫草酸、虫草多糖、麦角甾醇、有机酸和核苷类物质等[1-3]。新资源食品研究表明因其多种功能性活性成分协同作用，对治疗多种慢性疾病有显著影响，具有抗肿瘤、治疗白血病、提高免疫力、治疗心血管相关疾病、抑菌消炎等作用[4-5]，但由于化学合成难度大成本高，导致价格昂贵。因此，虫草素和腺苷常作为质量等级的评价指标，准确且便捷的检测方法对蛹虫草及其制品研究具有重要意义。

目前已知的虫草素和腺苷的提取方法有浸提法、超声法、回流法以及索氏提取法等[6]，一般提取虫草素的方法都能一并获得腺苷，并且结果表明水比乙醇更利于提取虫草素。本文通过前期提取效率、提取结果以及提取方法的易操作性的比对，选择超声法提取，而虫草素和腺苷的检测方法有液相色谱法（紫外检测器）、薄层色谱法等，受液相色谱等仪器灵敏度的限制，检测限仅能达到10 mg/kg。对于添加量不足千分之一的蛹虫草制品来说，以上方法已经无法满足其微量的功能性成分检测要求，本文通过统一采用超声提取前处理技术及液相色谱-质谱联用法研究测定虫草素和腺苷的含量，不仅降低检测低限从而扩大检测范围，更能为整合其他功能性成分的检测方法提供一个方向。

1.1 仪器与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱仪-串联四极杆质谱仪（ACQUITY®  UPLC-TQD，美国Waters公司）;电子天平（ML204T，梅特勒-托利多公司）;超声波清洗器（Prima公司）;菌株（蛹虫草来自沈阳师范大学特种菌业研究所）;虫草素、腺苷标准品（美国sigma公司）。

1.2 液相色谱分离条件（见表1）

色谱柱：ACQUITY UPLC®BHE-C18柱，2.1×50 mm，1.7 μm;流动相[7]：A）0.1%甲酸水溶液，B）甲醇;流速：0.2 mL·min-1;柱温：30 ℃;进样量：10 μL。

1.3 质谱检测条件

质谱系统：Xevo TQD;离子化模式：ESI+;毛细管电压：3.5 KV;雾化气温度：350 ℃;雾化气流速：650 L/h;锥孔气流速：50 L/h。

1.4 标准品的制备

准确称取虫草素和腺苷各10.0 mg，用水定容至100 mL，配制成100 mg·L-1的储备液，将上述储备液混合后逐级稀释至所需浓度。

1.5 样品的制备

通过优化NY/T 2116—2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定 高效液相色谱法》使提取更充分，准确称取粉碎后样品0.5 g，加入纯水20 mL，超声波提取120 min，5000 r·min-1，离心5 min，取上清液，并重复提取一次，定容至50 mL，待上机测定[8]。

1.6 检测低限

本试验采用直接配制纯标液和阴性样品提取液配制的标准溶液工作两种曲线来测定方法测定低限，将含两种被测物的混合标准储备液分别用水及提取液稀释，分别配制成含量为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 µg·L-1的标准工作液，按1.2和1.3所确定的色谱-质谱条件进行测定，同时绘制标准工作曲线。以信噪比（S/N）>10时虫草素和腺苷最小含量为液相色谱-质谱法的测定低限。

1.7 回收率

准确称取一定量样品，用微量移液器准确加入一定量的两种待测物混合标准溶液，配成0.05g·kg-1，0.1g·kg-1和0.5g·kg-1三个浓度水平进行回收实验，按上述实验步骤进行处理和测定，并计算回收率。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

本实验以被测物在色谱柱上的峰形、灵敏度和保留时间稳定性等为考察指标，对流动相比例进行了比较。由于虫草素和腺苷均溶于水，且正离子模式下0.1%甲酸水溶液能更好地电离，并结合液相色谱法测定虫草素和腺苷的参考条件，确定大比例0.1%甲酸水溶液为流动相A，在兼顾良好分离效果和离子化效率的同时，我们在50%甲酸水-甲醇比例基础上来测试调整，最终选择进行梯度淋洗。

2.2 质谱条件的优化

质谱采用自动连续进样方式进行全扫描检测，得到被测物的一级质谱图及其母离子，再用高纯惰性气体轰击该母离子，获得其二级质谱图及相应子离子。结果表明，两种物质均是正离子模式，并且响应值高于负离子模式，因此，本方法选择正离子监测的方式。采用本文中1.3质谱检测条件，再利用多反应监测（MRM）模式对已选定的定性离子对和定量离子对进行相关质谱毛细管电压、碰撞能量、锥孔电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最强，所得最佳质谱条件参数详见表2。在优化的色谱和质谱条件下两种被测物的0.5 µg·L-1混合标准溶液定量离子对和定性离子对以及Tic图见图1-图3。

2.3 样品前处理条件的选择

液相色谱-串联质谱能够很好地抗基质干扰，结合虫草素和腺苷的结构特点，两者均溶于水和乙醇，比较两者结果时发现，乙醇提取或部分乙醇提取的目标物提取率较低，水提取效果更好[10]，因此，采用水提取法处理后直接进样的方法。经试验，结果令人满意且水提取法更干净、更安全、更易于推广。

2.4 标准曲线、测定低限的确定

考虑实际样品测定，分别采取纯试剂和阴性基质样品提取液配制相同浓度的混合标准工作液，以峰面积为纵坐标，质量浓度（µg·L-1）为横坐标画曲线，并在相同的仪器参数下测定目标物的响应值并进行比较。实验结果表明：纯试剂配制的混合标准工作溶液的响应值和阴性基质提取液配制而成的混合标准工作溶液的响应值无明显差异，只是峰形有拖尾现象存在，其程度对分析结果影响不大，所以选择纯试剂配制的混合标准曲线。

用纯试剂配制成的质量浓度为0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 µg·L-1混合标准工作溶液，采用外标法定量，相关线性良好，而且腺苷的信噪比要高于虫草素，在浓度为0.01 µg·L-1时腺苷信噪比（S/N）>10，在浓度为0.05 µg·L-1时，虫草素信噪比（S/N）>10，为便于操作，确定统一的检测低限为0.05 µg·L-1，检测低限为5 µg/kg，相关参数见表3。降低检测低限有助于蛹虫草制品等相关食品的虫草素和腺苷成分的检测，为其保健功能提供重要的数据依据。

2.5 精密度与回收率

本研究通过阴性样品添加0.05 µg·L-1，0.1 µg·L-1和0.5 µg·L-1浓度点进行三次测试，该方法检测蛹虫草制品中虫草素和腺苷的加标回收结果見表4。两种目标物的平均回收率为98.0%～108.0%，RSD为0.41%～1.92%，表明该试验方法的回收率和重现性好。

2.6 不同方法分析

试验中，作者分别用液相色谱法[11]和液相色谱串联质谱法测定了珍硒虫草粉中虫草素和腺苷含量，取6次测量平均结果，结果见表5。结果表明，液相色谱串联质谱法检测虫草素和腺苷结果明显大于液相色谱法检测结果，这是因为液相色谱串联质谱法灵敏度高，响应效果好，并且取样量少，提取更充分。

2.7 样品分析

将五种不同酒基中添加蛹虫草的样品按上述方法进行分析，结果如表6，其中两组数据结果均低于NY/T 2116—2012高效液相色谱法测定的定量限30 mg/kg，另外《关于批准蛹虫草为新资源食品的公告》中也提及食用量≤2克/天，因此液相色谱串联质谱法检测蛹虫草制品中的虫草素和腺苷具有可行性。

3 讨论

本实验最终结果表明采用液相色谱串联质谱法测定蛹虫草及其制品的方法简单，灵敏度更高，结果更准确，适用于测定蛹虫草及其制品中虫草素和腺苷的含量。并且通过进一步的研究，蛹虫草中虫草酸、喷司他丁等其他功能性成分也可以通过液相色谱串联质谱法测定[12]，因此，此文为整合蛹虫草中功能性成分的测定方法打下基础，为以后的研究提供方法依据。

【参考文献】

[1] 黄年来，林志彬，陈国良，等.中国食药用菌学[M].上海：上海科学技术文献出版社，2010：1763.

[2] 肖亦农，韩梅，赵春燕.不同培养基对蛹虫草子实体甘露醇、多糖和矿质元素含量的影响[J].沈阳农业大学学报，2009，40（2）：227-229

[3] 陈宏伟，陈安徽，邵颖，等.蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究[J].食品与发酵工业，2009，35（6）：54-58.

[4] 刘桂君，周思静，杨素玲，等.蛹虫草中虫草素的研究进展[J].食品科学，2013（21）：408-413.

[5] 王建芳，杨春清.蛹虫草有效成分及药理作用研究进展[J].中医药信息，2005，2（5）：30-2.

[6] 钟艳梅，黄志全，温凯.人工蛹虫草固体培养基中虫草素的提取的研究[J].现代食品科技，2007，23（2）：41-2.

[7] 黄兰芳，郭方道，梁逸曾，等.HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量[J].中国中药杂志，2004，29（8）：762-764.

[8] 高冬.蛹虫草中虫草素测定的前处理条件优化[J].现代食品，2020（4）：192-194

[9] 张铭雅，朱志铭，姚迪，等.HILIC-MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的方法学[J].生物加工过程，2019，17（4）：430-436.

[10] 马麦艳，张相锋，焦子伟.蛹虫草主要成分虫草素、腺苷提取方法对比[J].现代农业科技，2019（5）：220-222+226.

[11] 简利茹，杜双田.HPLC与LC-MS/MS测定蛹虫草发酵液中虫草素的方法比较[J].食品科学，2013，34（14）：276-279.

[12] 张虹，吴雪美.高效液相色谱-质谱联用法分析冬虫夏草及其功能食品中活性成分[J].中国食品学报，2007，7（5）：113-120.

【作者简介】

王冠宇，女，1986年出生，工程师，学士，研究方向为食品检验。