X射线对人非小细胞肺癌细胞的辐射损伤效应研究*

吴晓博,赵 哲,王瑾瑜,公利鑫,李静怡△,潘克俭

1.成都医学院 基础医学院(成都 610500); 2.成都医学院 检验医学院(成都 610500)；3.成都医学院第二附属医院·核工业四一六医院(成都 610051)；4.成都医学院 生物科学与技术学院(成都 610500)

肺癌是我国肿瘤中发病率和病死率较高的恶性肿瘤，每年约160万人死于肺癌,已成为影响居民健康的主要疾病[1]。肺癌与生活方式、环境因素及基因组成等密切相关。根据组织学特征,肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占所有肺癌的85%，其中非小细胞肺癌中最为常见的亚型为腺癌[2]。目前，肺癌的治疗手段主要为手术切除和放、化疗[3]。放疗对于杀灭局部肿瘤的效果较好，但易产生并发症，如放射性肺炎、放射性肺纤维化及放射性食管炎[4]。

线粒体是电离辐射攻击的主要目标[5-6]。线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，mtFAM)是由核基因编码的一种多功能线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)蛋白，具有维持线粒体稳定的功能[7]。目前mtFAM蛋白在辐射损伤细胞中的功能研究较少，本研究将探讨mtFAM蛋白在X射线诱导的细胞辐射损伤中的作用，并进一步讨论mtFAM蛋白与肺癌放疗之间的联系。

1 材料与方法

1.1 细胞

本实验采用人非小细胞肺癌A549细胞，购自美国ATCC公司并保存于成都医学院科研实验中心。

1.2 主要设备及试剂

本研究细胞实验采用X-RAD225生物辐照仪，购自美国Precision X-ray公司。1640培养基、胎牛血清、胰酶、青霉素-链霉素双抗、磷酸盐缓冲液均购自以色列BI公司；四氢生物喋呤购于美国Cayman Chemical公司；结晶紫、二辛可宁酸(bicinchcnininc acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购于美国Thermo公司；蛋白酶抑制剂、活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；二甲基亚砜、膜联蛋白V(annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡检测盒、线粒体膜电位JC-10检测试剂盒购自北京索莱宝公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液、15%SDS-PAGE凝胶超快速配制试剂盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PDFV)膜和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)试剂盒购自上海碧云天生物科技公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、mtFMA购自美国Novus公司。

1.3 细胞预处理与分组

1.3.1 平板克隆存活实验 经辐射处理的3组细胞继续培养，每隔3 d更换1次培养基，12 d后终止培养。使用4%多聚甲醛固定细胞，结晶紫染色，拍照并统计细胞克隆数目，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数。每组设置3个复孔。

1.3.2 细胞凋亡检测 采用Annexin V-FITC/PI荧光探针，24 ℃避光孵育30 min，通过流式细胞仪检测3组细胞凋亡情况。

1.3.3 细胞内ROS检测 采用DCFH-DA探针，37 ℃避光孵育30 min，使用ACEA NovoCyte流式细胞仪检测3组细胞ROS的平均荧光强度。

1.3.4 细胞超氧阴离子检测 使用MitoTracker®Red CM-H2X ros探针， 37 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞仪检测3组细胞超氧阴离子变化情况。

1.3.5 细胞线粒体膜电位检测 使用JC-10探针，37 ℃孵育避光30 min，通过流式细胞仪检测3组细胞线粒体膜电位变化情况。

1.3.6 蛋白质印迹技术 提取3组细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定蛋白浓度，于15%的SDS-PAGE凝胶中进行电泳，将蛋白转移至PDFV膜上，用5%的牛血清白蛋白封闭，孵育mtFMA抗体，使用ECL试剂激发荧光，曝光。以β微管蛋白(β-Tubulin)为参照，采用凝胶成像系统分析目标蛋白表达水平。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 X射线对A549细胞存活的影响

克隆形成实验显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和20 Gy组A549细胞生长明显受到抑制，且20 Gy组细胞存活数量明显低于10 Gy组，差异有统计学意义(P<0.05)。细胞凋亡检测显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和20 Gy组A549细胞凋亡比例增加，且20 Gy组总凋亡率高于10 Gy组，差异有统计学意义(P<0.05)(图1、表1)。

图1 X射线辐射对A549细胞存活的影响

表1 3组A549细胞克隆形成率及总凋亡率比较

2.2 X射线对A549细胞内ROS及超氧阴离子水平的影响

ROS检测结果显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和20 Gy组A549细胞ROS水平明显上升，且20 Gy组ROS水平高于10 Gy组，差异有统计学意义(P<0.01)。超氧阴离子检测结果显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和20 Gy组超氧阴离子水平明显增加，且20 Gy组超氧阴离子水平高于10 Gy组，差异有统计学意义(P<0.05)(图2、表2)。

第二，手工书籍制作追求物化之美。书籍作为一种具有记录和查看功能的信息阅读载体，需要满足不同消费者在阅读时的触觉和视觉等感官方面的需求。因此，书籍设计者应重视书籍本身作为“物”的身份，在手工书的设计和制作过程中，更多的从消费者的角度出发，融入更多样化的元素，以满足其在审美和阅读上的需要。

图2 X射线辐射对A549细胞ROS及超氧阴离子的影响

表2 X射线辐射A549细胞后ROS及超氧阴离子变化

2.3 X射线对A549细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位检测结果显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和 20 Gy组A549细胞线粒体膜电位水平下降，且20 Gy组线粒体膜电位水平低于10 Gy组，差异有统计学意义(P<0.05)(图3、表3)。

图3 X射线辐射对A549细胞线粒体膜电位变化的影响

表3 X射线辐射对细胞线粒体膜电位变化情况

2.4 X射线对A549细胞mtFAM蛋白表达的影响

蛋白质印迹技术结果显示，与0 Gy组比较，10 Gy组和20 Gy组mtFAM蛋白的表达水平下降，且20 Gy组mtFAM蛋白的表达水平高于10 Gy组，差异有统计学意义 (P<0.05)(图4、表4)。

图4 蛋白质印迹技术检测X射线对A549细胞mtFAM蛋白表达的影响

表4 X射线辐射A549细胞后mtFAM蛋白表达情况

3 讨论

肺癌是影响人类健康常见的恶性肿瘤之一[1]。局部肿瘤病灶采用放疗杀伤较为彻底，但同时可引起放射性肺炎、放射性肺纤维等不良并发症，严重影响患者的生活质量。

本研究发现，随着A549细胞经X射线(10、20 Gy剂量)辐射后，细胞生长受到抑制，细胞凋亡增加，细胞内ROS及超氧阴离子水平上升，并呈现剂量依赖。该结果提示，随着X射线剂量增加，引发mtDNA的氧化损伤越明显。ROS的过度升高是氧化应激的主要特征，可导致mtDNA不稳定、影响呼吸链反应、改变线粒体膜的通透性及损伤线粒体膜,最终触发细胞凋亡。研究[8-9]表明，电离辐射损伤主要是由于辐射导致细胞内水分子电离激发，产生大量自由基和ROS,与本研究结果一致。

本研究结果显示，X射线辐射抑制A549细胞mtFAM蛋白的表达，且抑制效果呈剂量依赖，表明X射线辐射对A549细胞线粒体膜相关蛋白mtFAM具有抑制作用。电离辐射会对线粒体形态及功能造成影响，同时也会使mtDNA发生断裂。研究[10-11]表明，mtDNA与核DNA(nuclear DNA,nDNA)断裂程度相同的情况下，nDNA的修复能力是mtDNA的4倍。有研究[12]表明，在低剂量辐射下，与nDNA比较，mtDNA对细胞氧化应激更敏感。mtFAM是一种核基因编码的多功能mtDNA蛋白，参与mtDNA的转录、翻译及修复功能，以此来维持线粒体稳定[13]。然而，另有研究[14]发现，A549细胞经低剂量α粒子辐射后，mtFAM蛋白表达上调，这与本研究结果不一致，可能是剂量不同造成的差异。由此推断，A549细胞经低剂量X射线辐射后，mtFAM蛋白表达上调，促进损伤修复；而在高剂量X射线辐射后，mtFAM蛋白表达下调，是由于损伤程度超过A549细胞自身调节能力范围，从而损伤修复能力减弱。此外，研究[15]表明，mtFAM蛋白下调，A549细胞转移能力减弱，增殖能力下降以及对阿霉素敏感性增强。mtFAM缺失会导致线粒体功能紊乱[16]。

综上所述，本研究表明X射线辐射导致A549细胞线粒体受损，且通过抑制mtFAM蛋白表达，使线粒体的修复能力下降，最终诱导细胞凋亡，提示mtFAM蛋白可能是调控线粒体的重要蛋白。本研究不足之处在于未进行干预mtFAM蛋白及其相关信号通路的机制研究,未来实验中还有待进一步深入研究。