黄淮南部麦区小麦抗赤霉病育种技术体系优化

李正玲，张 煜，韩留鹏，王永霞，方宇辉，胡 琳，许为钢

（河南省作物分子育种研究院/河南省小麦生物学重点实验室/河南省麦类种质资源创新与改良重点实验室，河南 郑州 450002）

小麦赤霉病是一种由禾谷镰孢菌（Fusarium graminearumSchw.）引起的世界性病害。至21 世纪初，小麦赤霉病在我国常发于长江中下游麦区、黑龙江省春麦区、黄淮南部麦区[1‑3]。近几年，受带菌秸秆还田、灌溉面积扩大和气候变暖等因素影响，小麦赤霉病在黄淮南部麦区逐步由偶发病害发展成为了常发病害，发病严重的年份仅河南省发病面积就达333.3万hm2[3]，严重危害小麦产量、品质和食用安全。

我国长江中下游麦区是较早开展抗赤霉病小麦育种的区域，首先建立了小麦赤霉病抗性鉴定方法和评价标准，筛选和创新出一批世界公认并得到广泛利用的著名赤霉病抗源，建立了完备的抗赤霉病育种技术体系，相继选育出高抗和中抗赤霉病的优良品种，并在生产上大面积应用[4‑7]。黄淮南部麦区抗赤霉病育种最早开始于20 世纪80 年代[8]，但由于当时赤霉病的偶发性，抗赤霉病育种并未被大多数育种单位重视。进入21世纪后，随着赤霉病危害面积扩大，黄淮南部麦区许多育种机构将抗赤霉病育种列为主要攻关目标，建立了规模化的抗性鉴定平台，开展了大规模的抗性种质资源筛选，设置了抗赤霉病品种审定绿色渠道，一批抗病新品系进入区域试验[9‑10]。尽管如此，我国黄淮南部麦区小麦抗赤霉病育种仍处于起步阶段，需进一步完善规模化人工接种技术以提高接种效率，育种手段需进一步融入现代育种技术以提高育种效率。为此，以在育种过程中区分不同抗性后代材料为目的，在已有的小麦赤霉病抗性鉴定评价方法基础上，在黄淮南部麦区气候条件下对抗赤霉病育种中常用的3种人工接种赤霉病方法进行优化；同时以提高抗赤霉病育种效率为目的，对分子标记辅助选择和单倍体育种技术在黄淮南部麦区抗赤霉病育种中的规模化应用方法进行探索，并对黄淮南部麦区抗赤霉病育种技术要点进行总结，旨在为今后黄淮南部麦区小麦抗赤霉病育种提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料及试验地概况

病粒土表接种和孢子悬浮液喷雾接种试验的参试小麦品种有6个，分别为苏麦3号、扬麦158、安农8455、郑麦9023、郑麦0943、郑麦7698；单小花滴注接种试验的参试小麦品种有4 个，分别为苏麦3号、郑麦9023、郑麦0943 和郑麦7698。其中，苏麦3号、扬麦158、安农8455 分别是国家小麦赤霉病抗性鉴定行业标准中高抗、中抗、中感对照品种，郑麦9023、郑麦0943分别是国家小麦良种攻关黄淮南部麦区小麦赤霉病抗性鉴定的中抗、中感对照品种，郑麦7698为本研究的高感对照品种。

供试赤霉病菌种为包含有3个黄淮南部麦区赤霉病强致病力菌株（Fg18-1、Fg18-2、Fg18-4）和1个长江中下游麦区赤霉病强致病力菌株（Fa301）的混合菌种。其中，黄淮南部麦区赤霉病强致病力菌株由河南省农业科学院小麦分子育种团队分离鉴定，长江中下游麦区赤霉病强致病力菌株由江苏省农业科学院陈怀谷研究员提供。

小麦赤霉病人工接种方法比较试验分别于2017—2018 年度和2018—2019 年度在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地（新乡市原阳县，113°42′4″E 、35°0′17″N）进行，试验田土壤为砂壤土，中高肥力水平，前茬作物为玉米。试验期间试验点气温情况见表1，2018 年3—5 月气温较适宜镰孢菌子囊壳发育和孢子侵染，利于赤霉病发生，而2019 年3—5 月的平均气温较往年偏低，不利于赤霉病发生。

表1 2018年和2019年3月16日—5月15日试验点气温情况Tab.1 Temperature from March 16 to May 15 in 2018 and 2019 in the test field ℃

1.2 赤霉病接种试验设计

试验采用3种接种方法：病粒土表接种、孢子悬浮液喷雾接种、单小花滴注接种。病粒土表接种量设置2 个水平，分别为60 kg/hm2和120 kg/hm2。在小麦抽穗前1 个月分2 次将制备的玉米病粒均匀撒于小麦行间，接种后采用人工弥雾保湿至开花后7 d，每天1～2 次，每次10 min。孢子悬浮液喷雾接种量设置3 个水平，分生孢子浓度分别为103、104、105个/mL。在各品种扬花初期喷施于小麦穗部，每品种每处理喷施450 mL，接种后人工弥雾保湿7 d，每天3～5 次，每次5 min。单小花滴注接种量设置4个水平，分别为10、15、20、25 μL，孢子悬浮液的浓度均为105个/mL，于各品种扬花初期注射于麦穗中部的小穗中，每品种每处理至少接种10 穗，接种后采用套袋保湿的方法保湿5 d。试验采用随机区组设计，每品种种植3个重复，每重复6行，行长3.3 m，行距0.23 m，株距0.01 m。组间种植6 行其他小麦品种用作隔离。试验田的田间管理措施同当地高产田。

1.3 病害调查

在小麦乳熟期调查各品种赤霉病发病程度，对于病粒土表接种和孢子悬浮液喷雾接种的品种，分别调查病穗率和严重度，并计算病情指数；对于单小花滴注的品种，调查各接种穗的发病小穗数和总小穗数，并计算平均病小穗率。

病情指数=∑（各级病穗数×相应病级数）/（调查总穗数×最高病级数）。

1.4 有限回交结合分子标记辅助选择育种

以含有抗赤霉病基因Fhb1（Fusarium head blight 1）和Fhb7的山农079-8 为抗性亲本，以黄淮南部麦区高产品种郑麦1860为轮回亲本，进行有限回交。自BC1F1开始，利用Fhb1和Fhb7检测标记对回交后代进行分子标记检测，保留同时含有Fhb1和Fhb7基因的单株。2020 年和2021 年连续2 a 采用单小花滴注法对BC3F2和BC3F3所有单株的赤霉病抗性进行鉴定，每个单株接种2穗，乳熟期调查平均病小穗率。将选择到的优株种成株行，同时考察后代材料的农艺性状和赤霉病抗性，选择优良新品系。抗赤霉病基因Fhb1和Fhb7的检测方法同张煜等[11]的方法。

1.5 单倍体育种

以西农511/西农519//郑麦0943、西农519/徐农029//郑麦6687、周麦32/苏麦3号、中麦895/苏麦3号等4 个杂交组合的F1植株为材料，采用玉米花粉诱导单倍体技术创制双单倍体后代材料。将后代材料种成株行，株距6.67 cm，采用单小花滴注接种方法（每行接种不少于10 穗）对后代进行赤霉病抗性检测，以株高不大于85 cm、分蘖数不少于8个、小穗数不少于18 个、平均病小穗数不多于50%为标准，选择优良抗赤霉病品系。前2个组合的单倍体育种后代材料由云南省农业科学院顾坚团队创制，后2个组合的单倍体育种后代材料由河南省农业科学院小麦分子育种团队创制，方法均同顾坚等[12‑13]的方法。

1.6 数据处理与分析

采用Excel 2010 和SPSS 19.0 对试验数据进行方差分析和多重比较，多重比较采用LSD法（Least significant difference）。

2 结果与分析

2.1 3种接种方法的接种量对不同赤霉病抗性小麦品种病情指数的影响

2.1.1 病粒土表接种量 2018 年，气候条件较适宜小麦赤霉病发生，在2 种病粒土表接种量下，6 个小麦品种均充分发病，总体上不同抗性品种的病情指数在同一接种量下差异显著（表2）。2019 年，平均气温较往年偏低，6 个小麦品种的发病程度轻于上一年度，在60 kg/hm2接种量条件下，高感品种和中感品种之间的病情指数差异未达到显著水平，同时中抗品种扬麦158的病穗率低于国家农业行业标准中对鉴定试验有效的判定标准（中抗对照品种病穗率达到25%以上），且病情指数与高抗品种差异不显著；在120 kg/hm2接种量条件下，总体上不同抗性品种的病情指数差异显著。以上试验结果表明，病粒土表接种采用120 kg/hm2的接种量更能稳定区分出不同抗性品种。因此，在当前黄淮南部麦区气候条件下采用人工病粒土表接种小麦赤霉病适宜选用120 kg/hm2的接种量。

表2 供试小麦品种在不同病粒接种量条件下的病害发生情况Tab.2 Disease occurrence of the wheat cultivars with different inoculation amounts for soil surface inoculation method

2.1.2 孢子悬浮液喷雾接种量 2018 年，6 个小麦品种在3个孢子悬浮液喷雾接种量条件下均充分发病，发病程度随着孢子悬浮液浓度增加而增加，在孢子悬浮液浓度为103个/mL和104个/mL条件下可以很好地区别不同抗性品种之间的差异，而在浓度为105个/mL 条件下，中感和高感品种的病情指数差异不显著，中感品种发病过于严重（表3）。2019年，再次比较6个小麦品种在孢子悬浮液浓度为103个/mL和104个/mL 条件下的赤霉病发生情况，发现参试品种的发病程度轻于2018 年；在孢子悬浮液浓度为103个/mL 条件下，中抗品种扬麦158 和郑麦9023 的病穗率均低于25%，不能满足中抗品种病穗率在25%以上的要求；而在孢子悬浮液浓度104个/mL

表3 供试小麦品种在不同孢子悬浮液喷雾接种量下的病害发生情况Tab.3 Disease occurrence of the wheat cultivars with different inoculation concentration for spray inoculation method

条件下，不同抗性品种的病情指数仍可以表现出显著差异。以上试验结果表明，孢子悬浮液浓度采用104个/mL 更能稳定区分出不同抗性品种。因此，在当前黄淮南部麦区气候条件下采用人工孢子悬浮液喷雾接种小麦赤霉病适宜选用的孢子悬浮液浓度为104个/mL。

2.1.3 单小花滴注接种量 随着单小花滴注接种量的增加，参试小麦品种的病害发生程度逐渐增加，在15 μL、20 μL 和25 μL 接种量条件下，参试小麦品种均充分发病，且可以很好地区别不同抗性品种之间的差异；在10 μL接种量条件下，中抗品种和中感品种平均病小穗率的差异未达到显著水平（表4）。在实际操作过程中发现，采用单小花滴注接种苏麦3 号等小穗较细长的品种时，使用25 μL接种量容易使接种液溢出到邻近小穗或穗轴上，造成多个侵染点，干扰最终结果。因此，采用人工单小花滴注接种小麦赤霉病适宜选用15～20 μL 的接种量。

表4 供试小麦品种在不同单小花滴注接种量下的平均病小穗率Tab.4 Mean diseased spike rate of the wheat cultivars with different inoculation amount for single spikelet inoculation method %

续表4 供试小麦品种在不同单小花滴注接种量下的平均病小穗率Tab.4（Continued） Mean diseased spike rate of the wheat cultivars with different inoculation amount for single spikelet inoculation method %

2.2 不同育种技术在小麦抗赤霉病育种中的应用

2.2.1 有限回交结合分子标记辅助选择育种技术

对不同基因型的小麦BC3F2和BC3F3单株的赤霉病抗性进行接种鉴定，结果显示，虽然不同基因型平均病小穗率的标准差普遍偏大，但2 a 间平均病小穗率的变化趋势一致，含有Fhb1和Fhb7基因植株的平均病小穗率最小，不含Fhb1和Fhb7基因植株的平均病小穗率最大，含有Fhb1或Fhb7基因植株的平均病小穗率介于两者之间（表5）。以上结果说明，将Fhb1和Fhb7基因导入黄淮南部麦区高产品种郑麦1860中可以提高其赤霉病抗性，但由于同一基因型的不同单株病小穗率变幅较大，在育种选择时，应在分子标记检测结果的基础上进一步通过抗性表型鉴定来确定最终中选单株。结合大田表型鉴定和农艺性状选择，选育出以郑麦1860为背景的抗赤霉病新品系2019BC3-4700-3（图1A）和2019BC3-4700-8（图1B）。

表5 不同基因型小麦单株的平均病小穗率Tab.5 Mean diseased spikelet rate of each wheat plant with different genotypes

图1 抗赤霉病品系2019BC3-4700-3（A左）、2019BC3-4700-8（B左）与周麦18（A右、B右）接种后对比Fig.1 Comparison of disease occurrence between the resistance lines 2019BC3-4700-3（left in figure A），2019BC3-4700-8（left in figure B）and Zhoumai 18（right in figures A and B）after single spikelet inoculation

2.2.2 单倍体育种技术 河南省农业科学院小麦分子育种团队配制的4 个小麦杂交组合可以分为2类，第1 类是在黄淮南部麦区中抗/中感品种间组配杂交组合（西农511/西农519//郑麦0943、西农519/徐农029//郑麦6687），第2类是以黄淮南部麦区丰产性品种与丰产性较差但高抗赤霉病品种苏麦3号为亲本组配杂交组合（周麦32/苏麦3号、中麦895/苏麦3 号），采用玉米花粉诱导单倍体技术创制4个小麦杂交组合的双单倍体后代株系共1 405个，通过赤霉病抗性鉴定和农艺性状选择，筛选到抗赤霉病且农艺性状优良的株系9 个（表6）。对2 类杂交组合双单倍体后代株系的赤霉病抗性和农艺性状进行比较，发现第2 类组合单倍体后代株系的平均赤霉病抗性优于第1 类组合，但第2 类组合的平均株高较高、平均分蘖数和小穗数较少，丰产性较差。对2类杂交组合双单倍体后代的中选株系进行比较，发现第1 类组合选到8 个优良株系，中选率0.87%；第2 类组合选到1 个优良株系，中选率0.21%，且第2类组合的优良株系的赤霉病抗性与第1 类组合优良株系差异不大。以上结果说明，单倍体育种技术可以用于抗赤霉病育种以加速育种进程，在黄淮南部麦区开展抗赤霉病单倍体育种以黄淮南部麦区中抗/中感品种为亲本更适宜。通过多环境下赤霉病抗性鉴定和农艺性状选择，选育出抗赤霉病双单倍体育种新品系D18CH196-540（图2）。

表6 不同小麦杂交组合双单倍体后代的表现情况Tab.6 Comparison of field performance of double haploid plants from different cross combinations

图2 抗赤霉病品系D18CH196-540（左）与感赤霉病品系D18CH248-116（右）田间抗性比较Fig.2 Comparison of disease occurrence between the resistance line D18CH196-540（left）and the susceptible line D18CH248-116（right）in the field

3 结论与讨论

3.1 黄淮南部麦区小麦抗赤霉病育种接种鉴定技术优化

小麦赤霉病的发生易受气候条件和病原真菌量等因素影响，在黄淮南部麦区开展小麦赤霉病抗性育种应采取人工接种和人工保湿的方法，以确保为育种后代材料提供稳定的病害选择压。本研究在黄淮南部麦区气候条件下对小麦赤霉病3种常用人工接种方法的不同接种量进行比较，结果表明，病粒土表接种适宜采用的接种量为120 kg/hm2，在小麦抽穗前1 个月分2 次均匀撒于小麦行间；孢子悬浮液喷雾接种适宜选择孢子悬浮液浓度为104个/mL，在小麦扬花初期以100 mL/m2的喷施量喷于小麦穗部；单小花滴注接种适宜使用15～20 μL浓度为105个/mL 的孢子悬浮液，于小麦扬花初期注射到麦穗中部的小穗中。本研究结果中除病粒土表接种量较前人已建立的接种技术及行业标准有所提高外，其他接种方法的接种量与前人[14]研究结果一致。

3.2 现代育种技术在抗赤霉病育种中的应用

Fhb1和Fhb7基因是目前已知的抗赤霉病基因中效应较大的2 个基因，这2 个基因均已被克隆[15‑17]，且开发出了相应的功能标记和紧密连锁标记[18‑19]。本研究将有限回交和分子标记辅助选择技术相结合，将Fhb1和Fhb7基因导入黄淮南部麦区具有大面积应用潜势的小麦品种郑麦1860中，创制出较郑麦1860 赤霉病抗性明显提高的抗赤霉病小麦新品系，该结果说明分子标记辅助选择技术应用于小麦赤霉病抗性改良是有效的。本研究结果表明，同一基因型单株的病小穗率变幅较大，推测可能与其他微效抗病位点有关。因此，在利用分子标记辅助选择抗赤霉病品种时，应在分子标记检测结果的基础上进一步结合植株田间抗性表现来进行选择。

单倍体育种可以快速获得遗传背景稳定的育种后代品系，但对群体大小要求很高。通过比较不同类型亲本的单倍体育种后代，发现在黄淮南部麦区开展抗赤霉病单倍体育种应以黄淮南部麦区丰产性和抗病性兼顾的材料为亲本，如果以丰产性较差的材料为亲本或2 个亲本后代分离较大，建议经过F2的选择后再利用优株创制单倍体育种后代，这样可以提高培育出抗赤霉病品种的概率。

3.3 黄淮南部麦区抗赤霉病育种亲本选择及技术体系优化

当前，黄淮南部麦区抗赤霉病育种的主要难点不是无法选择到抗性好的品种，而是难以将丰产性与抗病性良好结合，只有在一定丰产性基础上提高抗病性，才能培育出在生产上大面积应用的抗赤霉病品种，而这与亲本选择有密切关系。目前，用于黄淮南部麦区抗赤霉病育种的亲本大体分为2 类，第1 类是抗病性突出但丰产性差的材料，第2 类是丰产性较好、抗病性中等的材料。在育种实践中以第1类材料作为亲本较难直接选育出可用于大面积生产应用的抗赤霉病品种，反而是以第2 类材料为亲本较易选育出丰产和抗病良好结合的抗赤霉病品种。但第1 类材料聚合有多个主效和微效基因，对选育高抗品种更具潜力。因此，2 类材料都应该在抗赤霉病育种中得到应用，仅需在育种目标和选择标准上有所区别。以第1 类材料为亲本的组合，应以创制抗病性突出的育种材料为目标，以抗病性选择为主，综合农艺性状较抗病亲本有明显改良即可；以第2类材料为亲本的组合，以直接选育抗赤霉病品种为目标，兼顾抗病性和丰产性的选择，抗病性以中抗为选择指标，综合农艺性状较亲本要有所提高。

基于本研究结果和抗赤霉病育种实践经验，对黄淮南部麦区小麦抗赤霉病育种技术进行了优化。对抗赤霉病育种杂交组合的单交F1进行赤霉病接种，宜采用孢子悬浮液喷雾接种，接种后弥雾保湿7 d；对于复交F1、F2、F3低世代分离群体，可采用以病粒土表接种为主、孢子悬浮液喷雾接种作为补充的接种方法，接种后弥雾保湿至开花后7 d；对于F4及以上世代，宜采用单小花滴注接种，接种后弥雾保湿或套袋保湿3～5 d。在后代选择时，单交F1只淘汰特别感病的组合；低世代分离群体应适当放宽农艺性状选择标准，重点选择丰抗结合的单株；对于F4及以上世代的选择，可在较好抗病性的基础上逐步提高综合农艺性状选择标准，同时采用多点试验的方法在多个环境下对表现优异的株系进行丰产性和抗病性鉴定。在品种选育过程中还应注意以下几点：抗病害扩展能力应作为抗病性选择的主要依据，故在选择时要注重穗轴的发病情况；所有世代都要对籽粒进行筛选，即使外表抗病，但病粒多也要淘汰；对于重点组合，可以采用单倍体育种技术创制稳定后代品系，如亲本含有Fhb1、Fhb7等抗赤霉病基因，可以自F3起开展分子标记辅助选择育种。