腐植酸对不同连作年限温室黄瓜土壤养分和微生物群落结构的影响

孙世君，刘 琦，叶英杰，魏 娜，郝水源

（1. 河套学院 农学系，内蒙古 巴彦淖尔015000；2. 通辽市农牧科学研究所，内蒙古 通辽 028000；3. 巴彦淖尔市农牧业技术推广中心，内蒙古 巴彦淖尔 015000）

黄瓜是我国设施栽培的主要瓜类蔬菜之一，栽培面积大、经济效益高[1]。然而，由于茬口安排单一，施肥量多和复种指数高，土壤连作障碍问题日益突出，严重影响了黄瓜产业的持续发展[2‑4]。因此，如何克服设施内土壤连作障碍成了设施黄瓜生产面临的重要问题。前人研究发现，增施有机肥可以在一定程度上缓解土壤连作障碍[5‑7]。王雪玉等[8]的研究发现，添加生物炭能显著提高黄瓜连作10 a 土壤中的真菌丰度，促进植株生长；胡云等[9]的研究表明，高粱绿肥对改良设施内连作土壤条件和优化设施土壤微生物群落结构同样具有积极作用。

腐植酸是生态农业和无公害农业中常用的有机肥料之一，具有改善土壤理化性质、提高肥料利用率和调节植物体内酶活性等特点。关于腐植酸的功能研究多集中在对作物生长及产量的影响上。杨苏等[10]的研究发现，适量施用腐植酸会使玉米产量增加27.2%～50.6%；沈建生等[11]的研究表明，腐植酸处理能够显著提高草莓硬度、可溶性固形物含量；孙利萍等[12]的研究表明，番茄果实的维生素C、番茄红素、可溶性糖和有机酸含量也与增施腐植酸有关。腐植酸主要通过提升土壤速效钾、有机质含量，进而增强植物光合作用，从而提高植物产量和品质[13]。然而，关于施用腐植酸缓解设施内土壤连作障碍方面的报道较少。因此，以温室黄瓜连作4 a和11 a 的土壤为研究对象，探究增施腐植酸后对不同连作年限温室黄瓜土壤中微生物群落结构的影响，揭示腐植酸修复根区土壤的微生态机制，以期为推广腐植酸、防治设施蔬菜土壤连作障碍提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为津优35 号。供试土壤为日光温室内连续栽培4 a 和11 a 黄瓜的0～30 cm 耕层土壤（以下分别简称连作4 a 土壤、连作11 a 土壤），以未栽培过蔬菜的温室外土壤作为对照（以下简称温室外对照土壤）其基本理化性质见表1。供试腐植酸水溶肥料由内蒙古际美生物科技有限公司提供，腐植酸含量为252 g/L、全氮含量为94.3 g/L、速效磷含量为117.2 g/L、速效钾含量为93.1 g/L、pH 值为7.12。

表1 供试土壤基本理化性质Tab.1 Basic physical and chemical properties of test soil

1.2 试验设计

试验于2020 年9—10 月在内蒙古鲜农农牧业有限公司博士科研工作站现代化温室内进行。采用花盆（上口直径20 cm、下口直径15 cm，高16 cm）栽培黄瓜，随机区组设计，共设7 个处理，CK：温室外对照土壤；T4：连作4 a 土壤；300T4：连作4 a 土壤+腐植酸300 倍液；600T4：连作4 a 土壤+腐植酸600 倍液；T11：连作11 a 土壤；300T11：连作11 a 土壤+腐植酸300倍液；600T11：连作11 a土壤+腐植酸600 倍液。每个处理重复3 次，每个重复10 盆。2020 年9 月5 日于黄瓜幼苗两叶一心时定植，每盆定植1 株。2020 年9 月12 日缓苗后开始进行腐植酸处理，腐植酸一次性施入。增施腐植酸时既要确保腐植酸能够浸透80%的土壤，又不从花盆底部溢出。未增施腐植酸的处理，用等体积的水代替。日常管理中，除每次浇等体积的水（每次浇水均未从花盆底部溢出）外，其他管理措施均相同。

1.3 土壤样品采集及制备

在增施腐植酸20 d后，每个重复随机选取5盆，用抖根法收集黄瓜根际土壤。过2 mm 筛，将土壤分成2 份。一份立即置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于测定微生物多样性；一份在室内自然风干过筛后保存，用于测定土壤理化性质。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 土壤理化性质测定 采用钼锑抗比色法测定土壤速效磷含量；采用火焰光度计法测定速效钾含量；采用浓硫酸消煮-流动分析仪法测定全氮含量；采用重铬酸钾外加热法测定有机质含量；采用pH计测定土壤pH值。

1.4.2 DNA 提取和高通量测序 每个土样分别称取0.500 g，3 次重复，按照E.Z.N.A.®Soil DNA Kit 试剂盒的使用说明，提取土壤微生物基因组总DNA。用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物对各样品内细菌的16S rDNA 基因（V3—V4）进行PCR扩增；用ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA‑A-3′）和ITS1R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）引物对各样品内真菌的ITS1可变区进行PCR 扩增。PCR 扩增产物用Illumina MiSeq PE250 测序平台进行高通量测序，建库和测序委托联川生物技术股份有限公司完成。

1.5 数据处理

运用SPSS 20.0 软件进行土壤理化性质指标单因素方差分析；测序获得原始数据后，利用QIIMEV1.8.0 软件对序列进行操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU）聚类，以获得各样品在门、属水平上的细菌和真菌群落组成；使用Origin 8.5 软件绘图及进行α 多样性分析；利用Canoco 4.5 软件进行冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

2 结果与分析

2.1 腐植酸对不同连作年限温室黄瓜土壤理化性质的影响

从表2可以看出，T4和T11处理速效磷含量、速效钾含量、全氮含量和有机质含量均显著高于CK，T11 处理速效钾含量、全氮含量又显著高于T4，T11处理pH 值与CK 差异不显著，而T4 处理pH 值显著低于CK。可见，随连作年限增加，土壤养分含量呈增加趋势。连作4 a土壤增施腐植酸后，300T4 处理速效磷含量、速效钾含量、全氮含量和有机质含量均高于T4 和600T4 处理，且300T4 处理速效钾含量和全氮含量均显著高于T4和600T4处理，pH值则显著低于T4处理。连作11 a土壤增施腐植酸后，除全氮含量外，300T11 处理速效磷含量、速效钾含量和有机质含量均显著高于T11 和600T11 处理，pH 值则显著低于T11。

表2 不同处理对温室黄瓜土壤理化性质的影响Tab.2 Effect of different treatments on physical and chemical properties of cucumber soil in greenhouse

2.2 腐植酸对不同连作年限温室黄瓜土壤细菌和真菌群落α多样性的影响

由表3 可知，随着土壤连作年限增加，T4 和T11处理细菌和真菌的OTU数量、Shannon指数和Chao1指数均低于CK，而T11 处理细菌的Shannon 指数和真菌的OTU 数量、Shannon 指数和Chao1 指数均显著高于T4处理，说明连作导致土壤微生物群落多样性降低，但连作11 a 土壤细菌和真菌的多样性高于连作4 a 的土壤。连作4 a 土壤增施腐植酸后，除600T4 处理细菌的Shannon 指数显著低于T4 处理（降低了8.38%）和300T4 处理、Chao1 指数显著高于300T4 处理外，其余各指标均无显著差异。连作11 a 土壤增施腐植酸后，各处理间细菌和真菌的OTU 数量、Shannon 指数和Chao1 指数均无显著差异。综上，腐植酸对不同连作年限土壤细菌和真菌多样性的影响不一致。

表3 不同处理对温室黄瓜土壤细菌和真菌群落α多样性的影响Tab.3 Effect of different treatments on α diversity of bacterial and fungal communities in greenhouse cucumber soil

2.3 腐植酸对不同连作年限温室黄瓜土壤微生物群落结构组成的影响

2.3.1 不同处理温室黄瓜土壤细菌在门水平上的丰度变化 由图1 可知，在门分类水平上构成温室黄瓜根际土壤优势细菌群落的依次为变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟 杆 菌 门（Bacteroidetes） 、放 线 菌 门（Actinobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和疣微菌门（Verrucomicrobia）。与CK 相比，连作土壤中变形菌门、疣微菌门和酸杆菌门的相对丰度降低，其他菌门的相对丰度升高。连作4 a 的土壤增施腐植酸后，600T4 处理优势菌种占细菌总数的比值高于T4 和300T4 处理，且分别高2.00%和1.96%，主要表现在变形菌门、绿弯菌门和放线菌门上，而酸杆菌门和浮霉菌门的相对丰度则低于T4 和300T4。连作11 a 的土壤增施腐植酸后，600T11 处理优势菌种占细菌总数的比值高于T11 和300T11，其中变形菌门、芽单胞菌门和拟杆菌门的相对丰度高于T11 和300T11 处理。说明不同连作年限土壤增施腐植酸后增加了土壤优势菌群的比值。

图1 不同处理温室黄瓜土壤细菌在门水平上的丰度变化Fig.1 Change of bacterial abundance in greenhouse cucumber soil at phylum level under different treatments

2.3.2 不同处理温室黄瓜土壤细菌在属水平上的丰度变化 由图2可知，在属的分类水平上，随着连作年限的增加，RB41、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和MND1 的相对丰度整体上显著降低，假单胞菌属（Pseudomonas）和Altereythrobacter的相对丰度则显著 升 高。 T4 处 理 的Chryseolinea、Anaerolinea、Thermomarinilinea和特吕珀菌属（Truepera）的相对丰度高于CK 和T11 处理，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）的相对丰度则相反。连作4 a 土壤增施腐植酸后，300T4 处理Chryseolinea和RB41 的相对丰度最高，600T4 处理假单胞菌属、Altereythrobacter和Thermomarinilinea的 相 对 丰 度 最高。连作11 a 的土壤增施腐植酸后，300T11 处理Chryseolinea、RB41、MND1、Thermomarinilinea和 特吕珀菌属的相对丰度均高于T11 和600T11 处理，600T11 处理芽单胞菌属、假单胞菌属、Altereythrobacter和鞘氨醇单胞菌属的相对丰度均最高。

图2 不同处理温室黄瓜土壤细菌在属水平上的丰度变化Fig.2 Change of bacterial abundance in greenhouse cucumber soil at genus level under different treatments

2.3.3 不同处理温室黄瓜土壤真菌在门水平上的丰度变化 由图3 可知，在门分类水平上构成温室黄瓜根际土壤优势真菌群落的依次为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）。连作增加了土壤中子囊菌门的相对丰度，而担子菌门和壶菌门的相对丰度则降低。连作4 a 土壤增施腐植酸后，子囊菌门的相对丰度显著升高，且表现为600T4 处理>300T4 处理>T4 处理；担子菌门的变化规律则相反，以600T4 处理担子菌门的相对丰度为最低。连作11 a 的土壤增施腐植酸后，子囊菌门的相对丰度降低，且300T11 和600T11 处理子囊菌门相对丰度分别较T11 处理降低5.61%和2.22%，300T11 处理担子菌门、接合菌门和被孢霉门的相对丰度最高，600T11处理壶菌门的相对丰度高于300T11和T11处理。

图3 不同处理温室黄瓜土壤真菌在门水平上的丰度变化Fig.3 Change of fungal abundance in greenhouse cucumber soil at phylum level under different treatments

2.3.4 不同处理温室黄瓜土壤真菌在属水平上的丰度变化 进一步在属水平上对真菌进行分析。由图4 可知，随着连作年限的增加，毛壳菌属（Chaetomium）、枝顶孢属（Acremonium）的相对丰度先升高后降低，丛赤壳属（Nectria）、被孢霉属（Mortierella）、帚枝霉属（Sarocladium）和赤霉属（Gibberella）的相对丰度降低，鬼伞属（Coprinus）、卷旋 孢 属（Cirrenalia）和 假 霉 样 真 菌 属（Pseudallescheria）的相对丰度升高。连作4 a 土壤增施腐植酸后，600T4 处理毛壳菌属的相对丰度显著低于300T4 和T4 处理，而帚枝霉属和链格孢属（Alternaria）的相对丰度显著高于300T4 和T4 处理。连作11 a 的土壤增施腐植酸后，毛壳菌属、枝顶孢属和卷旋孢属的相对丰度降低，而被孢霉属、鬼伞属和假霉样真菌属的相对丰度升高。连作11 a 的处理中，300T11处理被孢霉属和鬼伞属的相对丰度较高；600T11处理假霉样真菌属的相对丰度最高。

图4 不同处理温室黄瓜土壤真菌在属水平上的丰度变化Fig.4 Change of fungal abundance in greenhouse cucumber soil at genus level under different treatments

2.4 腐植酸对不同连作年限温室黄瓜土壤环境因子与微生物群落组成影响的RDA分析

RDA 能够直观反映各处理土壤群落结构与土壤理化性质的关系。由图5 可知，细菌和真菌总变异量分别为52.86%、48.01%，而且随连作年限增加，土壤细菌和真菌的样品点均有明显分离现象。说明连作年限对细菌和真菌的群落结构影响较大。增施腐植酸后，300T11 和600T11 处理细菌和真菌与T11 处理在RDA2 方向上都存在明显分离，说明腐植酸较大地改变了连作11 a 土壤细菌和真菌的群落结构。

图5 细菌（A）和真菌（B）群落结构与土壤性质间的RDA分析Fig.5 RDA of bacterial（A）and fungal（B）community structure and soil physiochemical properties

3 结论与讨论

温室是环境相对可控的半封闭空间，受人为干预的程度较大。由于温室内作物的长期连作，导致其土壤出现质量退化、有害微生物增加等问题[14]。腐植酸作为自然界中广泛存在的大分子有机物质，被用于设施内土壤改良方面的研究渐多。本研究结果表明，随连作年限的增加，土壤速效养分和有机质含量显著升高，而pH 值显著下降，这与李晶晶等[15]的研究结果一致。增施腐植酸后连作4 a 和11 a的土壤速效磷含量、速效钾含量、全氮含量和有机质含量均升高，这与吴炳孙等[16]的研究结果类似。一方面可能由于腐植酸具有多孔性和较强表面吸附能力，能够有效结合土壤中的磷离子和钾离子，使其形成络合物，减少土壤对磷离子和钾离子的固定，进而增加土壤中速效磷含量和速效钾含量[17]；另一方面可能由于腐植酸作为有机肥料，有机质含量和有机氮含量高，再加上有机质能减少化学氮素的损失，因此使得土壤中有机质含量和全氮含量均升高[18]。pH 值作为土壤重要的基本理化性质之一，对土壤肥力性质、微生物群落结构都具有较大影响。本研究增施腐植酸后，土壤pH 值降低，这可能与腐植酸中的羧基、羟基等含氢官能团在土壤中多为酸性，可有效增加土壤中H+浓度有关[19]。

大量研究表明，微生物种群结构失衡，有益微生物数量减少，病原微生物数量增加，且微生物种群多样性降低，是土壤连作障碍发生的主要原因之一[20]。本研究也取得了同样的结果，连作土壤细菌和真菌的OTU 数量、Shannon 指数和Chao1 指数均降低。腐植酸因其具有增加土壤孔隙度、降低土壤容重、改善土壤物理结构的特性，为土壤微生物生长与繁殖提供了良好的栖息环境。袁婉潼[21]研究发现，适量增施腐植酸可显著提高盐碱土壤细菌和真菌的数量。本研究结果表明，连作4 a 土壤增施腐植酸后，只有600T4 处理细菌的Shannon 指数显著低于T4 和300T4 处理，而对土壤真菌的多样性并无显著影响。张慧等[22]的研究亦表明，施用腐植酸肥料对烟草土壤细菌群落丰富度的促进效果不显著，黄腐酸施入土壤后不能显著改善微生物多样性[23]，这可能是由于增施腐植酸的浓度较低所致。YI等[24]的研究也证实了这一观点，当施入腐植酸的质量分数由0.5%增加至2.0%时，土壤微生物多样性才会明显升高。此外，腐植酸自身结构比较稳定，含有大量不易被分解利用的芳香烃类物质，而土壤微生物群落结构相对稳定，施肥时间短难以真实反映对土壤微生物多样性的影响。

腐植酸可以通过改变土壤理化性质等方式间接影响微生物群落。本研究结果表明，连作导致土壤中变形菌门、疣微菌门和酸杆菌门的相对丰度降低，增施腐植酸可显著提高变形菌门等的相对丰度。在属水平上的研究同样表明，腐植酸改变了细菌属的群落结构。这与施用腐植酸型生物有机肥对烟草土壤细菌群落组成的研究结果类似[22]。有研究表明，土壤碳、氮含量高，有利于变形菌门的生存[25]，而本研究结果也表明，增施腐植酸后土壤有机质含量和全氮含量上升，提高了土壤中变形菌门的相对丰度。研究表明，细菌群落结构受土壤环境、作物种类等因素的影响[26‑28]。施入腐植酸改变了土壤理化性质，因此，对土壤中细菌优势类群相对丰度产生了一定影响。本研究结果还表明，不同连作年限土壤中施入腐植酸后，真菌的相对丰度在不同门和属水平上表现不同。其中，连作4 a 的土壤中子囊菌门的相对丰度升高，担子菌门的相对丰度降低。这可能由于子囊菌门属于土壤腐生真菌，主要分解环境中的木质素等有机质，腐植酸施入后提高了土壤有机质含量，因此促进了菌群的快速增长与繁殖[29]；担子菌门对有机质中碳的利用能力有限，土壤有效养分过多，反而对担子菌门的生长具有抑制作用[30]。连作11 a 的土壤增施腐植酸后，子囊菌门的相对丰度降低，而担子菌门、接合菌门和被孢霉门的相对丰度却升高，这可能是由于真菌的生存能力相对较低、受外界环境干扰程度大，导致稳定性差所致，但需进一步研究。

细菌和真菌作为土壤中主要的微生物类群，通常随土壤养分、pH 值等外界条件的变化而变化[31]。本研究发现，土壤全氮含量和有机质含量与细菌和真菌群落结构变化有关。

综上所述，增施腐植酸提高了连作温室黄瓜的土壤养分，使pH 值趋于中性，腐植酸对细菌和真菌α多样性总体上无显著影响，连作4 a的土壤施入腐植酸600 倍液降低了细菌的Shannon 指数。增施腐植酸提高了部分优势细菌和真菌在门和属水平的相对丰度。