镉、砷胁迫下接种丛枝菌根真菌对烤烟镉、砷累积及生理特性的影响

张志芳，豁泽春

（商丘学院 风景园林学院，河南 商丘 476000）

镉（Cd）和砷（As）是造成土壤污染的重要重金属物质，二者皆具有高移动性和高毒害性等特征[1]。未受污染的土壤中Cd 正常水平为0.01～0.70 mg/kg，但由于人类活动和高地质背景，土壤Cd含量往往超标。Cd 可与植物细胞结构蛋白和代谢酶的硫醇基团（SH）结合，破坏SH 的功能活性和氧化还原调节能力[2]。As 在土壤中以多种形式存在，土壤条件是影响As形态的主要因素，通气状况良好的土壤中主要是As5+形态，而As3+多存在于淹水环境中[3]。植物体吸收As的过程中，砷酸盐通过与磷酸盐竞争磷转运蛋白进入植物体，在三磷酸腺苷（ATP）合成中替代磷的功能地位，致使植物光合效率下降，且与Cd类似，As与SH 同样具有高亲和力[4]。植物可以在分子生化水平上采取不同的策略降低体内的重金属含量。一种常见的机制是合成植物螯合素（PCs）[2，5]，PCs 是富含半胱氨酸的一种硫醇肽，其合成以谷胱甘肽（GSH）为底物，通过组成型植物螯合酶催化的转肽化作用合成PCs[6‑7]。植物体中一旦进入一定剂量的Cd、Zn、Hg、Cu、Pb、As等重金属，细胞质中的肽转化被激活，高尔基体会迅速合成PCs，PCs 通过其硫基官能团螯合重金属，PCs-Cd、GSHCd、PCs-As3+和GSH-As3+复合物可以通过液泡膜运输到液泡中，然后在液泡中被固定，从而在一定程度上缓解重金属带来的不利影响[2，8]。

丛枝菌根（Arbuscular mycorrhiza，AM）真菌隶属于球囊菌亚门，是一类在土壤中广泛存在的重要功能性微生物，其可与大多数陆地植物的根建立互惠共生关系，改善植物矿质养分吸收、促进植物生长以及缓解环境胁迫等[9‑11]。前人研究表明，重金属胁迫下，AM 真菌可以分泌球囊霉素络合土壤中的污染物，或者通过菌丝作用将重金属吸附并固定在菌丝胞间内[12‑13]。烤烟是一种根系发达且生物量较高的植物，这意味着其具有较大的重金属累积潜力。对人类而言，吸食含重金属的卷烟，重金属会随着主流烟气进入人体，导致机体功能衰退[14]。目前，已发现在田间烟草根际中存在大量的AM 真菌，且AM 真菌作为接种菌对烟草生长、生理代谢和烟草品质等方面皆具有较好的促进作用[15]，但Cd、As重金属胁迫下AM 真菌对烤烟相关生理影响的研究鲜有报道。鉴于此，探索接种AM 真菌对不同浓度Cd、As 胁迫下烟草生长、生理代谢及重金属累积的影响，以期为应用AM 真菌防控烟草Cd、As 重金属污染提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点和供试材料

试验于2020 年5—6 月商丘学院玻璃温室中进行。供试烟草品种为豫烟7 号，采用改进的无菌漂浮育苗在光照室中培养至五叶期。

AM 真菌为摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae），购自北京农林科学院植物营养与资源研究所。菌株采用白三叶草进行扩繁，试验接种物由孢子（20个/g）、菌丝、根系残体和土壤组成。

供试土壤取自商丘农田生态系统国家野外科学观测站原始林区（115°34′37″E，34°35′51″N）的0～20 cm 土层，土壤质地为砂壤，去除植物残体及碎石，经风干后混匀过3 mm 网筛。供试土壤皆经高压蒸汽灭菌（121 ℃，1×105kPa，2 h）去除土壤土著AM 真菌的干扰，待土壤冷却后混合备用。土壤含有机质13.35 g/kg、全氮0.87 g/kg、碱解氮82.8 mg/kg、有效磷20.11 mg/kg、速效钾113.64 mg/kg、有效砷0.11 mg/kg、有效镉0.16 mg/kg。

外源Cd 为氯化镉（CdCl2），外源As 为砷酸二氢钠（Na2HAsO4·7H2O），均购自国药集团化学试剂有限公司。试验所用N、P、K 肥分别采用分析纯NH4NO3、KH2PO4 和K2SO4，均购自上海亿欣科技有限公司。

1.2 试验设计

试验采用完全随机设计，根据国家土壤Cd、As污染3 级标准和土壤Cd、As 污染状况，Cd、As 均设置0、1、30 mg/kg（以纯量计）3 个水平，分别为CK（Cd=0 mg/kg、As=0 mg/kg）、Cd1（Cd=1 mg/kg），As1（As=1 mg/kg）、Cd30（Cd=30 mg/kg）、As30（As=30 mg/kg）。上述处理皆设置接种AM 真菌（AM）和不接种AM 真菌（NM）2 种方式，试验共10 个处理组合方式，每个处理5次重复。

采用圆桶状黑色聚乙烯塑胶盆栽器具（底部直径16 cm，高25 cm），使用前采用75%乙醇与紫外线灭菌，每盆装土6 kg。将肥料（N=2.5 g，N-P2O5-K2O=1∶1∶2）、菌剂与土壤提前混合均匀，其中AM 处理盆钵中加入AM 真菌菌剂100 g，即保持每盆孢子数为2 000 个，NM 处理加入等量的灭活菌剂。选取长势相同且无病害特征的壮苗，每盆种植1株，保持80%土壤持水量，烟株幼苗培养20 d 后以溶液形式加入外源Cd、As。种植期间不定时加入无菌水，其他管理措施相同。Cd、As 处理后30 d 收获植株，试验共培养50 d。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 根系侵染率及根系性状 培养50 d 时选取每个处理长势均一的烟株，采用清水小心清洗获得完整根系。采用Epson Perfective V700 photo 扫描仪对根系进行扫描，采用WinR HIZO-Pro 软件（Regent Instruments LA2000，Canada）分析根系体积、总根长、根系表面积、根系平均直径等参数。根系形态测定完毕后进行AM 侵染率测定，将根切成1 cm 长的小段，采用品红溶液染色，光学显微镜下用网格交叉记数法[16]计算菌根侵染率（m，%）、丛枝丰富度（A，%）和囊泡丰度（V，%）。

1.3.2 烟株株高、叶面积、光合特征及生物量

于培养第49天（晴天）上午10：00使用LI-6200便携式光合测定系统测定从下往上数第5～7片叶的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度和胞间CO2浓度（Ci）等指标。温度和光量子密度参数参考文献[17‑18]设置。培养50 d 时选取每个处理长势均一的烟株，采用卷尺测量烟株株高，测定烟株从下往上数第7 片有效叶片叶面积，叶面积（cm2）=0.634 5×长×宽。将烟株地上部、根系置于烘箱中105 ℃杀青30 min，70 ℃烘干至恒质量并称量记录。各处理重复3次。

1.3.3 植物Cd、As 含量 测定地上部和根系生物量后，将各处理样品粉碎制成待测样品。分别称取1.000 g 地上部、根系粉碎样品于Teflon PFA 窄口瓶中，加入2 mL HNO3和2 mL 30% H2O2，在封闭条件下高温消解得到消解物。将消解物转移至25 mL容量瓶中，并用去离子水补足刻度制成待测样。使用配有Varian VGA-77 氢化物发生器的光谱仪（Varian SpectrAA-250 Plus，USA），采用氢化物发生-原子吸收光谱法（HG-AAS）测定As 含量，采用电感耦合等离子体光谱仪（ICP-OES）测定样品中的Cd含量。

1.3.4 谷胱甘肽（GSH）和植物螯合素（PCs）的质量摩尔浓度 培养50 d 后称取根系、地上部鲜样1.00 g，加入三氯乙酸（DTPA）和5%磺基水杨酸顺时针快速研磨，在低温高速离心机（4 ℃、10 000 r/min）下离心10 min，获得上清液。将上清液分为两部分，一部分用于测定GSH 的质量摩尔浓度，即按照总谷胱甘肽（GSH）DTNB 速率检测试剂盒相关说明测定GSH 的质量摩尔浓度；另一部分用于测定PCs 的质量摩尔浓度。将上清液通过0.45 μm 孔径过滤器针头（Goettingen15A，Germany），采用配备自动采样器的HPLC 系统（PerkineElmer model 225，USA）通 过 反 相PurospherLiChroCART C18 小 柱（Merck GmbH 33A，Germany）提取得到官能团粗提取物。将三氟乙酸（0.05%）与色谱级乙腈进行复配，设置26 个百分比梯度（1%～26%），加入粗提物和300 mL Ellman 试剂，以0.7 mL/min 的进速进行分离，采用412 nm 柱进行衍化，采用高效液相色谱仪（PerkinElmer200，USA）测定粗提物相关含量，PCs的质量摩尔浓度测定采用购买的GSH 标准物（Germany）进行样品标准定量。以上分析均委托生工生物（上海）股份有限公司完成。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2013 进行数据整理，采用SPSS 19.0进行LSD检验分析（P<0.05），采用Origin 8.0 进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟菌根侵染状况的影响

由表1 可知，未接种（NM）情况下均未发现AM真菌侵染情况。接种AM 真菌情况下，CK 菌根侵染率为73.55%，不同水平As 处理与CK 无显著差异，而1、30 mg/kg Cd 处理菌根侵染率分别为51.25%、41.26%，显著低于上述处理；就丛枝丰富度而言，与CK（35.78%）相 比，1、30 mg/kg Cd 处 理 分 别 为15.99%、13.47%，均显著低于CK，而不同水平As 处理丛枝丰富度与CK 差异不显著；各处理泡囊丰度的表现趋势与菌根侵染率、丛枝丰富度基本一致。值得注意的是，接种AM 真菌情况下，3 个指标均以CK 最大，1 mg/kg As 和Cd 处理菌根侵染率、丛枝丰富度、泡囊丰度均有所下降，30 mg/kg As 和Cd 处理下，上述指标总体上表现为进一步降低，可见，随着Cd、As水平提高，烟株菌根化下降，其中Cd对AM真菌侵染影响较大。

表1 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟菌根侵染状况的影响Tab.1 Effects of AM fungi on mycorrhizal infection of flue-cured tobacco under different Cd and As levels %

2.2 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟生长及光合特征的影响

由表2 可知，接种AM 真菌（AM）处理的烤烟地上生物量和叶面积均高于不接种（NM）处理。以CK-AM 处理地上生物量最高，为17.26 g/盆，显著高于其他处理；且无论是AM 处理还是NM 处理中，30 mg/kg Cd、30 mg/kg As 处理烤烟地上生物量均低于1 mg/kg 水平处理，表明重金属浓度越高，植物生长受到的抑制作用越大。就叶面积而言，CK-NM 与CK-AM 处理、AS1-NM 与AS1-AM 处理存在显著差异，其他Cd、As水平不同接菌方式间无明显差异。

表2 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟生长及光合特征的影响Tab.2 Effects of AM fungi on growth and photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco under different Cd and As levels

光合特征参数与生物量、叶面积的表现规律相似，即接种AM 真菌（AM）处理的烤烟光合特性参数均高于NM处理，表明接种AM真菌对植株光合作用具有一定促进作用。其中，胞间CO2浓度（Ci）以CKAM 处理最高，显著高于1、30 mg/kg Cd 处理；而As处理中，无论是否接种AM 真菌，0（CK）、1、30 mg/kg As 处理均无显著差异。净光合速率（Pn）以Cd30-NM 处理最低，显著低于其他处理；以CK-AM 处理最高，As1-AM 处理其次，二者无显著差异且均显著高于其他处理，其增幅分别为15.03%～51.11%、13.71%～50.35%。各处理气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）的表现趋势与Pn基本一致。

2.3 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟根系形态的影响

由表3 可知，各处理烤烟根系生物累积量介于1.15～3.02 mg/盆，以Cd30-NM处理最低，Cd1-NM其次，二者间差异显著且均显著低于其他各处理。不同水平Cd、As 处理烤烟根系生物累积量均以AM 处理显著大于NM 处理。根系体积以CK-NM、CK-AM最大，显著高于Cd30-NM、As30-NM 处理，但与其他处理无显著差异，Cd30-NM、As30-NM 处理根系体积无显著差异。根系直径以CK-AM 最大，显著大于CK-NM 及其他As、Cd 水平处理；而1、30 mg/kg Cd、As 处理中均表现为AM 处理大于NM 处理，但差异不显著。总根长以CK-AM 最大，As1-AM 处理其次，二者无显著差异，但较其他处理分别显著增加5.40%～24.03%、4.29%～23.14%；Cd1、As1 水平下AM 与NM 处理皆存在显著差异，Cd30、As30水平下AM 与NM 处理差异不显著。各处理根系表面积规律与总根长基本一致。

表3 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟根系形态的影响Tab.3 Effects of AM fungi on root morphology of flue-cured tobacco under different Cd and As levels

2.4 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟不同部位Cd、As累积的影响

植物根系和地上部Cd、As 累积量通常取决于土壤中Cd、As 的有效水平。由图1a 可知，30 mg/kg Cd 胁迫下，未接种AM 真菌（NM）处理烟株根系Cd含量为52.19 mg/kg，接种AM 真菌（AM）处理较之下降23.19%，但差异不显著；1 mg/kg Cd 胁迫下NM 处理烟株根系Cd 含量与AM 处理亦无明显差异。30 mg/kg Cd 胁迫下，NM 处理烟株地上部Cd 含量高达106.59 mg/kg，AM处理烟株地上部Cd含量较之显著降低40.55%，而1 mg/kg Cd浓度处理下AM与NM处理烟株地上部Cd 含量无显著差异。由图1b 可知，30 mg/kg As 胁迫下，NM 处理根系As 含量为157.24 mg/kg，AM 处理根系As 含量较NM 处理显著降低78.50%；而地上部As 含量表现为AM 处理较NM 处理下降20.94%，但二者间差异不显著。1 mg/kg As下AM 处理烟株根系、地上部As 含量与NM 处理均无显著差异。

图1 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟不同部位镉（a）、砷（b）累积的影响Fig.1 Effects of AM fungi on cadmium（a）and arsenic（b）accumulation in different parts of flue-cured tobacco under different Cd and As levels

2.5 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟不同部位GSH质量摩尔浓度的影响

由图2 可知，任一水平Cd、As 处理下，AM 处理烟株根系GSH 质量摩尔浓度均较NM 处理显著增加，表明AM 真菌可促进烟株根系GSH 的分泌。且不论是Cd 处理还是As 处理下，各处理皆以30 mg/kg 水平下根系GSH 质量摩尔浓度最高。AS、Cd 各水平下，AM 处理烟株地上部GSH 质量摩尔浓度均高于NM 处理，但仅1 mg/kg Cd、1 mg/kg As、30 mg/kg Cd 胁迫下AM 处理与NM 处理差异显著，其中，30 mg/kg Cd 下，AM 处理地上部GSH 质量摩尔浓度达到最高，为240.46 nmol/mg，较NM 处理显著增加430.00%。不同As 浓度处理中，AM 处理地上部GSH 质量摩尔浓度表现为CK>As30>As1，但三者无显著差异。

图2 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟不同部位GSH质量摩尔浓度的影响Fig.2 Effects of AM fungi on GSH concentration in different parts of flue-cured tobacco under different Cd and As levels

2.6 不同Cd、As胁迫下接种AM真菌对烤烟不同部位PCs质量摩尔浓度的影响

由图3可知，CK根系和地上部均未检测到PCs，其合成似乎受到Cd、As 施用的诱导。1 mg/kg Cd下，AM 处理根系PCs 质量摩尔浓度显著大于NM 处理，而30 mg/kg Cd 下则相反。1 mg/kg As 下，AM 处理根系PCs 质量摩尔浓度与NM 处理无显著差异，而30 mg/kg As 下，AM 处理根系PCs 摩尔质量浓度较NM处理显著减少58.49%。

图3 不同镉、砷水平下AM真菌对烤烟不同部位PCs质量摩尔浓度的影响Fig.3 Effects of AM fungi on PCs concentration in different parts of flue-cured tobacco under different Cd and As levels

1 mg/kg Cd 下，AM 处理地上部PCs 摩尔质量浓度大于NM 处理，但二者无显著差异；30 mg/kg Cd下，与NM 处理相比，AM 真菌处理地上部PCs 摩尔质量浓度显著降低。1、30 mg/kg As 下，AM 处理地上部PCs 摩尔质量浓度均小于NM 处理，但处理间差异均不显著。无论1 mg/kg还是30 mg/kg处理下，地上部PCs 摩尔质量浓度均表现为Cd 处理大于As处理。

3 结论与讨论

本试验结果表明，盆栽培养50 d 后CK 菌根侵染率最高，1、30 mg/kg Cd 胁迫下其侵染率分别显著降低30.32%、43.90%，说明Cd 胁迫下AM 真菌仍可与烟株形成共生结构，但其共生关系显著减弱。与CK 相比，Cd 胁迫下菌根化植株的丛枝丰富度和泡囊丰度均显著降低，而As 处理无显著变化，说明AM 真菌对烟株的侵染定殖受到Cd 毒害较为明显，而As处理则未对其产生明显的抑制作用。

植物生物量和经济产收主要来源于光合作用产生的碳水化合物[19]，根系是植物吸收矿质养分的主要器官。因此，根系性状和光合特征是植物发育优劣的重要体现，植物根系性状、叶片光合特性较好，说明植株生长协调、光合作用进程顺利，有利于作物生理代谢[18，20]。本研究中，烟株地上部Pn、Gs等光合参数以及总根长、根表面积、根体积等根系性状整体上均表现为接种AM 真菌处理（AM）优于不接种处理（NM）。杨世芳等[21]研究发现，藜麦在接种AM 真菌后，根系总根长、表面积、平均直径和体积均显著高于未接种处理。陈笑莹等[22]研究表明，菌根化玉米具有较高的最大荧光（Fm）、可变荧光（Fv）以及最大光化学效率（Fv/Fm），并且叶片Pn 和Gs 显著增加。前人研究表明，AM 真菌可提高宿主对养分的获取能力，宿主根系及生理参数的提高可能是养分得到改善的结果[23‑25]。此外，本研究进一步表明，随着土壤中As、Cd 含量的提高，烟株光合参数和根系特征均不同程度降低，在30 mg/kg 水平时最低，表明As、Cd 对烟草生理有一定的毒害抑制性。就生理特征和干物质量累积来看，Cd胁迫对烟株的抑制作用大于As胁迫。

本研究结果表明，接种AM 真菌降低了烟株根系及地上部Cd积累，但在1 mg/kg Cd 胁迫下，AM 处理地上部和根系的Cd 含量与NM 处理差异不显著。而在LUGON 等[26]的研究中，同样使用了原始土壤（Cd 有效性为0.49 mg/kg），接种AM 真菌处理显著降低了1 mg/kg Cd 胁迫下烟株不同部位的Cd 含量；此外，本研究中，1 mg/kg Cd 胁迫下烟株地上部Cd含量（14.15 mg/kg）明显高于LUGON 等[26]的检出水平（6.78 mg/kg），推测可能是胁迫环境下不同地区AM 真菌种类存在功能差异的结果[23]。本研究进一步表明，NM 处理条件下，1 mg/kg Cd 胁迫下地上部Cd 含量低于根系，在30 mg/kg Cd 胁迫下则反之。前人研究表明，当环境中Cd 浓度较低时，AM 真菌可通过菌丝截留功能使得Cd 主要累积在黑麦草（Lolium perenneL.）根系中[27]，而当浓度过高时，为保证根系的养分吸收及代谢，Cd则通过长距离运输主要累积于地上部[28]，本研究结果与之基本一致。

本研究中，30 mg/kg Cd 胁迫下，AM 处理烟株根系PCs 质量摩尔浓度显著低于NM 处理，但NM 与AM 处理烟株根系Cd 含量无显著差异；30 mg/kg Cd胁迫下，AM、NM处理烟株地上部PCs质量摩尔浓度与其Cd 含量表现一致，均为AM 处理显著低于NM处理。前人研究表明，在外界胁迫下烟株能够调控PCs快速合成以缓解胁迫毒害带来的损伤[2，28‑29]。本研究表明，接种AM真菌可刺激根细胞中GSH合成，AM 处理植株的GSH 质量摩尔浓度较NM 处理更高，而植物螯合剂PCs的质量摩尔浓度更低，这可能是PCs 已作用于螯合转运重金属Cd 的结果[2，29]。因此，30 mg/kg Cd 胁迫下，AM 处理烟株根系、地上部Cd 含量较相应部位的NM 处理分别降低23.19%、40.55%。

As 处理的As 累积规律与Cd 处理的Cd 累积规律存在一定差异。30 mg/kg As 胁迫下，NM 处理根系As含量较高，AM 处理根系As含量较之显著降低78.50%，AM 处理地上部As 含量与NM 处理相比降低20.94%，但二者无显著差异，表明AM 真菌可有效阻遏根系吸收高浓度As，同时抑制As 向地上部移动。这可能是由于AM 真菌具有将重金属固定在菌丝细胞壁或菌丝体内部以及分泌有机酸降低根际pH 值的作用，从而达到降低重金属有效性的结果[30‑31]。本研究中，1 mg/kg As 胁迫下AM 处理烟株根系生物量比NM 处理高8.12%，这可能与植物体GSH 含量增加从而提高了植株的胁迫能力有关[32]。进一步研究表明，与30 mg/kg As 胁迫水平相比，1 mg/kg As 胁迫下根系、地上部As 含量均较低，且AM 处理与NM 处理无明显差异；30 mg/kg As 胁迫下，AM 处理根系As 含量显著低于NM 处理，且无论1 mg/kg 还是30 mg/kg 水平下，根系As 含量皆高于地上部，从侧面说明As从根系向地上部转移的量较少。这可能是AM 真菌菌丝阻遏了根系对As 的吸收以及由共生关系产生的促生作用带来的生理缓解效应[33]。本研究中，根系和地上部GSH 质量摩尔浓度表明，接种AM 真菌提高了根和地上部GSH 质量摩尔浓度，从而增加了合成PCs的底物有效性，表明AM 真菌可提高Cd、As胁迫下植物体的GSH 分泌水平，这有助于络合Cd、As等有害元素。

综上，本研究表明，摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae）可与烟草形成良好的共生关系，从而改善烟株光合特征及根系生长发育。此外，AM 真菌可提高烟草植株中抗氧化剂GSH 的分泌与合成、降低烤烟地上部和根系中Cd、As 累积。本研究结果为AM 真菌应用于烟草安全生产提供了理论依据。