新疆边境昆玉市亚洲璃眼蜱形态及分子生物学鉴定

周 鹏，李 正，张生帅，李 川，向郑琬琪，武军元*

（1.塔里木大学动物科学与技术学院，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室，新疆阿拉尔 843300；3.新疆巴州尉犁县第二师三十三团农业发展服务中心，新疆巴音郭楞 841505）

蜱属节肢动物门、蛛形纲、寄螨目、蜱总科，是一类寄生于哺乳动物、爬行类、鸟类和两栖类等脊椎动物体表的专性吸血寄生虫，是多种自然疫源性疫病的传播媒介及病原的贮存宿主[1-3]，可携带并传播病毒、细菌、立克次体和原虫等多种病原微生物。蜱分为硬蜱科、软蜱科、纳蜱科和恐蜱科，其中以硬蜱科危害最严重[4]。截至目前，世界上蜱总科有21个属，共计960种，其中硬蜱科有14属740种，软蜱科有5属218种，纳蜱科和恐蜱科各1种[5-6]。中国已报道的蜱类有2科9属124种，其中软蜱科2属14种，硬蜱科有7属110种[5,7-10]。

现有研究普遍认为，蜱传疫病与特定的蜱种有关，而蜱种分布与地理纬度有关。新疆地貌景观复杂多样，为多种蜱虫提供了繁衍生息所需的适宜条件。于心等[11]整理编著出版的《新疆蜱类志》报道了20世纪50年代至1995年新疆区域内分布的蜱种种类，是新疆蜱类研究相对较系统的成果。近年来，新疆南疆塔克拉玛干沙漠边缘亦出现新蜱种鉴定的报道[12]。昆玉市位于新疆南疆和田地区边陲，属典型的沙漠气候，该地区蜱种鉴定的报道相对较少。为进一步了解新疆南疆地区的蜱类分布组成，本研究采用形态学方法结合分子生物学技术对昆玉市骆驼体表寄生的蜱虫进行了分析鉴定，以期丰富相关资料及研究结果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蜱样来源

从新疆南疆和田地区昆玉市昆泉镇散养骆驼体表采集寄生的蜱虫，共获得硬蜱150只。采集的蜱虫采用75%酒精浸泡，常温条件运送至新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室。

1.1.2 主要试剂

TransTaq®-T DNA Polymerase、Trans2K®DNA Marker、EasyPure® PCR Purification Kit、EasyPure®Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金生物技术有限公司产品；GeneGreen核酸染料（RT210）、DNase/RNase-Free去离子水（RT121）、2×Taq Plus PCR MasterMix（KT205）、DH5a感受态细胞（CB101）、pGM-T载体相关试剂盒购自天根生化科技有限公司；血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）购自天根生化科技有限公司。

1.1.3 主要仪器

T100TMThermal Cycler（Bio-rad公司）、全自动蛋白免疫印迹定量分析系统（普诺森生物科技有限公司）、台式高速离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）、恒温培养振荡器（天津欧诺仪器股份有限公司）。

电热恒温培养箱、数显恒温水浴锅、电热鼓风干燥箱、SW-CJ-2FD净化工作台（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

参考文献[13]设计蜱种鉴定的特异性引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物序列见表1。

1.2.2 蜱形态学鉴定

将自新疆南疆和田地区昆玉市昆泉镇散养骆驼体表采集寄生的蜱虫依次采用不同梯度的酒精溶液振荡漂洗5次，以灭菌的ddH2O振荡漂洗1次，参照文献《蜱的系统分类学》对蜱样的盾板、假头、气门板、肛侧板、腹面、背面等进行对比观察。

1.2.3 蜱虫总DNA提取

将经过振荡漂洗的蜱样转移至RNase-free的1.5 mL离心管，使用灭菌的眼科剪刀充分剪碎，按照血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒说明书上的操作步骤提取蜱样的总DNA。

1.2.4 蜱虫分子生物学鉴定

采用所设计的16S rDNA基因特异性引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系（25μL）：2×PCR Mix 12.5μL、10 mmol/L上游引物0.5μL、10 mmol/L下游引物0.5μL、cDNA 1.5μL、ddH2O 10μL，混匀后进行PCR反应。

PCR扩增反应条件：94℃5 min，92℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，38个循环；72℃8 min。

反应结束后，取2μL PCR扩增产物于1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果并拍照记录，鉴定正确的PCR产物，回收后送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.5 序列分析及16SrDNA遗传进化树构建

应用序列分析软件DNAStar对测序结果进行拼接处理，将所得序列与GenBank中公布的蜱虫16S rDNA序列进行同源性比较，采用Mega 7.0软件的Neighbour-Joining方法构建进化树，分析其遗传进化关系。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果（见图1、图2）

由图1可知，雌蜱盾板椭圆多角形，宽度小于长度；大刻点稀少，中小刻点数量不等；颈沟深长，延伸至盾板侧缘；气门板呈逗点形。

图1 雌蜱外部形态Fig.1 External morphology of female ticks

由图2可知，雄蜱盾板卵圆形，全覆盖；大刻点稀少，中小刻点数量不等；颈沟深长，超过盾板中部；气门板呈曲颈瓶形。

图2 雄蜱外部形态Fig.2 External morphology of male ticks

2.2 分子生物学鉴定

2.2.1 线粒体16S rDNA扩增结果（见图3）

图3 线粒体16S rDNA PCR电泳Fig.3 16S rDNA PCR electrophoresis of mitochondrion

由图3可知，采用蜱种鉴定的特异性引物对提取的总DNA样品进行分子生物学检测，在460 bp处有一目的条带，与预期片段大小相符。

2.2.2 线粒体16S rDNA系统进化分析（见图4）

由图4可知，采集蜱虫为亚洲璃眼蜱，根据NCBI数据库已公布的亚洲璃眼蜱线粒体16S rDNA的序列，应用Mega 7.0软件构建系统进化树，发现检测样本的线粒体16S rDNA基因序列与已知的新疆亚洲璃眼蜱处在同一分支上，可以很好地聚类。

图4 蜱种基于16S rDNA基因的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene

3 讨论

蜱作为一种重要的吸血性体外寄生虫，其叮咬不仅可以直接造成动物损伤，而且蜱发育过程中的卵、幼蜱、若蜱和成蜱4个阶段均可携带多种病原，是多种自然疫源性疾病的传播媒介及贮存宿主。目前，已经明确通过蜱虫传播的疾病主要包括莱姆病、森林脑炎、新疆出血热、土拉弗氏菌病、立克次体病、蜱媒回归热、发热伴血小板减少综合征、布氏杆菌病、西尼罗河热、汉坦病毒肺综合征以及泰勒虫、巴贝斯虫等原虫病。近年来，国内外不断有新的蜱传疫病发生。其中，新疆周边发生的蜱传疫病主要为乌兹别克斯坦的“Karshi”病毒病[14]、俄罗斯新西伯利亚地区的克麦罗沃病毒病[15]以及与新疆南疆毗邻吉尔吉斯斯坦的Burana病毒病[16]。

蜱传疫病与特定的蜱种有关，而蜱种分布与地理纬度有关。开展特定地区的蜱种分布研究可丰富当地蜱传疫情的材料，还可以对比研究同一纬度的国内外其他地区在蜱带病原种类和疫病流行方面的相似性和差异性。

新疆地域辽阔，约占全国总面积的1/6；陆地边境线超过5 600 km，约占全国陆地边境线的1/4，是中国面积最大、陆地边境线最长、毗邻国家最多的省区。新疆境内地貌景观复杂多样，“三山夹两盆”的独特地形特点使得新疆出现交错分布的地貌景观；其中，南疆地区既有沙漠又有局部绿洲，适宜的气候、植被和土壤条件为蜱虫生长提供了良好的寄主环境。长期以来，受不同环境因素的影响，来自不同地域和不同生态环境中的蜱种往往存在遗传变异的特点。

前期试验的调查发现，新疆南疆地区的优势蜱种主要是图兰扇头蜱，也有其他蜱种呈现季节性分布[17]。本研究对采自新疆和田地区昆玉市骆驼体表的蜱虫进行了形态学以及16S rDNA分子生物学鉴定，结果表明，采集的蜱样全部为亚洲璃眼蜱。16S rDNA系统进化分析表明，和田地区骆驼体表寄生的璃眼蜱与新疆南疆地区尉犁县采集的亚洲璃眼蜱亲缘关系较近，与北疆石河子、福海以及疆外内蒙古鉴定株的亲缘关系相对较远，初步呈现出地域差异的进化规律性。前期试验研究表明，图兰扇头蜱具有区域进化的分子多样性[17-18]。亚洲璃眼蜱是否也具有同一规律性，尚需要收集更多地区的材料加以证实。

4 结论

昆玉市骆驼体表寄生的蜱虫为亚洲璃眼蜱，该蜱种呈现地域差异的进化规律性。