头孢菌素的聚合物分析

胡昌勤 张夏 李进

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

对药物杂质谱(impurity profile)的控制一直是当前国内外药品质量控制的关注热点[1-2]。β-内酰胺抗生素主要包括青霉素和头孢菌素两大类，头孢菌素作为临床中最重要的一类β-内酰胺抗生素，是当前国内仿制药一致性评价的热点品种。针对β-内酰胺抗生素杂质谱控制中的最薄弱环节——聚合物控制问题[3]，作者已经对青霉素类抗生素聚合物分析的进展进行了综述[4]，也对头孢菌素中7-氨噻肟头孢菌素的聚合物分析策略与方法进行了专门的讨论[5]。鉴于头孢菌素的聚合反应与其3位侧链和7位侧链的结构密切相关，根据头孢菌素7位侧链的特点，将其分为7位侧链含有伯氨基的头孢菌素(7-氨噻肟头孢菌素是其中的一类)和不含伯氨基的头孢菌素；根据其3位侧链的特点，将其分3位侧链为烷基结构和具有易解离基团的头孢菌素(图1)；然而，实际产品中7位侧链不含有伯氨基结构且3位侧链为烷基结构的头孢菌素较少存在。本文通过对近年来文献[6-11]的回顾性分析，将分别对7位侧链含有伯氨基的头孢菌素(不包括7-氨噻肟头孢菌素)和7位侧链不含有伯氨基但3位侧链具有易解离基团的二类头孢菌素的聚合物分析进展进行总结。

1 7位侧链具有伯氨基结构的头孢菌素

7位侧链含有伯氨基结构的头孢菌素，除7-氨噻肟头孢菌素外，目前临床中主要有头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯和头孢拉定。该类头孢菌素的3位侧链较为稳定，不易发生降解反应；7位侧链结构与青霉素中氨苄西林、阿莫西林的6位侧链结构相似；故认为它们的聚合反应与氨苄西林、阿莫西林的聚合反应相似。根据对氨苄西林、阿莫西林聚合反应的认知[4,12]，其主要聚合反应途径为氨基攻击β-内酰胺环聚合，其他可能的聚合反应即使在强制聚合反应中也较难发生；虽然氨基与β-内酰胺环的聚合可以形成多种差异异构体，但在实际产品中通常仅存在一个主要的异构体，其他异构体的含量较低可以忽略。以头孢氨苄为例，在中国药典2015版头孢氨苄有关物质色谱系统中，通过调整有机相比例使头孢氨苄的保留时间约为5 min，主峰后可见5个主要杂质峰；利用柱切换-LC/MS/MSn技术证明其中3个杂质峰(MP-1、IMP-2和IMP-3)的分子量均为694.8 Da，质谱裂解信息也基本相同，提示它们为头孢氨苄二聚体差向异构体；其中MP-1的含量最高，是主要聚合产物[6]；与对氨苄西林、阿莫西林的聚合分析结果[4]相似。

对聚合物质谱裂解信息的解析是聚合物分析中的重要环节，掌握头孢菌素的质谱裂解规律有助于对聚合物质谱裂解途径的推断。该类头孢菌素典型的质谱裂解规律见图2A[13]，据此，可以较好地解释头孢氨苄二聚体二级质谱图中的主要碎片离子(图2B～C)；而通过高分辨质谱(HRMS)确定头孢氨苄二聚体的精确分子量，分析其元素组成(C32H35O8N6S2+)，并与所推测结构的理论分子量相比较(误差仅差-1.384 ppm)，可进一步确证所推测的头孢氨苄二聚体结构的正确性[6]。

采用高效凝胶色谱(HPSEC)-柱切换-LC/MS方法，分析头孢拉定在非水溶液强制聚合中形成的聚合物杂质[7]：在HPSEC的HPSEC-2和在HPSEC-3色谱峰中均发现头孢拉定二聚体(MW698.2)；柱切换分析显示它们在RP-HPLC中呈3个色谱峰，与头孢氨苄二聚体相似；此外，在HPSEC-4和HPSEC-5色谱峰中分别发现头孢拉定三聚体(MW1047.6)和头孢拉定四聚体(MW1396.8)，但它们在RP-HPLC中均不呈尖锐的色谱峰，提示在HPSEC色谱峰中可能为多个差向异构体的混合物。质谱分析显示，头孢拉定二聚体的质谱裂解途径与头孢氨苄二聚体相似；头孢拉定三聚体在质谱分析中产生的m/z699、m/z655和m/z521的特征离子，提示在裂解过程中产生了头孢拉定二聚体；而m/z891的特征离子提示结构中存在β-内酰胺环(图3)。

综上，该类头孢菌素的主要聚合反应为侧链氨基与β-内酰胺环的反应，实际产品中聚合物主要为二聚体，仅在非水溶液中强制聚合才易产生三聚、四聚体等多聚体。采用RP-HPLC方法，利用产品中的二聚体作为指针性聚合物可以表征产品中的聚合物总量，是理想的质控分析方法，但应用药典收载的有关物质方法时通常应进行优化，保证聚合物杂质被洗脱出。质谱分析中该类头孢菌素聚合物的聚合位点易断裂，形成药物单体或低聚物；聚合物的主要裂解途径符合药物单体的质谱裂解规律。通过高分辨质谱(HRMS)的精确分子量，得到聚合物的元素组成，可以进一步确证推测的聚合物结构的正确性。

2 7位侧链不具有伯氨基结构的头孢菌素

7位侧链不具有伯氨基结构的头孢菌素，实际产品中3位侧链多具有易解离的基团，如头孢哌酮、头孢唑林、头孢硫脒等。根据目前对β-内酰胺抗生素聚合反应的认知[4,12]，母核羧基作为活性基团与另一分子的β-内酰胺环或3位侧链的反应是最可能的聚合反应途径；与β-内酰胺环的反应通常可形成一对差向异构体，而与3位侧链的反应通常形成单一的聚合物(图4)；由于该类头孢菌素的3位侧链易被水解，因而与β-内酰胺环反应形成的二聚体可能存在三种3位侧链水解物(按文献[5]可分别命名为水解物I、水解物Ⅱ和水解物Ⅳ)，而与3位侧链反应形成的二聚体仅能产生一种水解物。

比较该类头孢菌素质谱裂解途径(图5)与图2A的差异：虽然它们均可发生β-内酰胺环的A裂解反应，但A2碎片的丰度在不同化合物中的差异较大，R3为甲氧基取代时A2离子丰度最弱；当其失去3位侧链后，不再发生经典的β-内酰胺环B裂解反应，且A裂反应主要产生A3碎片，A1离子丰度较弱， R3为甲氧基取代时没有A1离子[13-14]。

文献[8]报道了2个头孢唑林二聚体(分子量均为794 Da，分别称之为聚合物1和聚合物2)；根据头孢菌素的聚合反应机理推测分子量为794 Da的头孢唑林二聚体可能有5种结构(图6A)。结构C由于不含β-内酰胺结构，在质谱分析中被首先排除。利用上述质谱裂解规律分析头孢唑林聚合物1：其二级质谱图中可见β-内酰胺环的A2特征裂解碎片(m/z628)，同时存在m/z455和m/z473的头孢唑林碎片和头孢唑林开环物特征碎片，故其可能为结构A或D(图6B)；但根据质谱裂解途径分析无法判断其究竟是何种结构[8]。利用结构已知的头孢唑林二聚体对照品(结构D)(广州牌牌生物科技有限公司)进行验证，对照品保留时间与二聚体1相同，即证明头孢唑林二聚体1为结构D(未发表资料)。

文献[8]未能推测出聚合物2的可能结构。由于聚合物2 的质谱图中出现了经典的β-内酰胺环A3特征离子(m/z635)(图6B)，故推测其可能结构为B或E(具有可解离的3位侧链)。由于质谱图中未出现特征的头孢唑林碎片(m/z455)，但出现了m/z473的特征碎片(与头孢唑林开环物特征碎片相同)，因此，对m/z473特征离子的解析成为关键。如果头孢唑林二聚体在3位侧链断裂前发生经典的β-内酰胺环B裂解反应，则能形成m/z473的特征离子(图6C)；据此，可推测出聚合物2的质谱裂解途径(图6D)。同样，仅根据质谱裂解途径分析无法判断聚合物2究竟是结构B或E。由于文献[8]中未发现聚合物2具有同分异构体(提示不存在差向异构体)，且通过对头孢唑林、聚合物1和聚合物2的UV光谱比较，认为二聚体2母核的共轭结构发生了变化(二聚体2通过酯键对具有完整结构的头孢唑林母核的共轭结构影响较大)，因此认为聚合物2更可能为结构E(最终应通过杂质对照品进行确认)。

文献[9]采用HPSEC-柱切换-LC-MS技术分析注射用头孢硫脒中的聚合物，发现实际样品中存在分子量为884的二聚体(图7D)，推测其可能为羧基与3位侧链的聚合产物(图7A)；虽然羧基与的β-内酰胺环的反应也可能形成分子量为884的二聚体(图7B)，但质谱裂解途径分析不支持该结构(无法解释m/z473的头孢硫脒特征离子碎片)(图7C)，因而支持文献推测的结构的正确性。

文献[10]采用二维RPLC-QTOFMS技术在头孢哌酮钠舒巴坦钠样品，发现4个头孢哌酮二聚体杂质峰：杂质峰6与峰7的质谱信息相似(MS1均为m/z1175.2797，分子式为C48H50N14O16S3)，杂质峰8与峰9的质谱信息相似(MS1均为m/z1291.2926，分子式为C50H54N18O16S4)，提示互为差向异构体。但作者推测它们为侧链仲氨基与β-内酰胺环的聚合产物(图8A)。然而，该反应机理在以往的研究中从未被证实，根据目前对β-内酰胺抗生素聚合反应的认知[4,14]，母核的羧基与β-内酰胺环聚合可以产生一对二聚体差向异构体(MW1290，分子式为C50H54N18O16S4)(图8B)，且对其质谱裂解途径进行分析可以较好地解释峰8/峰9质谱图中的主要碎片离子，故认为峰8/峰9更可能为图8B的结构。图8B的二聚体脱去3位侧链形成的内酯结构(MW1174，分子式为C48H50N14O16S3)与峰6/峰7的结构信息一致(图8C)，对其质谱裂解途径进行分析(图8D)，也可较好地解释其质谱图中的主要碎片离子(图8F)；虽然母核的羧基与3位侧链的反应也可以形成分子量1174的二聚体(图8D)，但该反应不能产生差向异构体；因此认为峰6/峰7更可能是图8C的结构。

纵上，目前对该类头孢菌素聚合物分析的研究较少，虽然认为它们可以通过头孢菌素母核的羧基攻击另一分子的β-内酰胺环或3位侧链发生聚合，但何种反应为主要的聚合反应途径目前缺乏理论计算的支持；在实际分析中，似不同结构的化合物聚合反应途径不完全相同。对该类头孢菌素实际产品中的聚合物进行分析，通常仅发现二聚体且含量均较低；在水溶液中进行强制聚合，通常不能增加聚合物的含量，而高湿条件下固态聚合是增加聚合物含量的有效途径。在利用质谱裂解途径推断聚合物的结构时，通过分析β-内酰胺环的A裂解碎片，可以帮助判断聚合反应位点：如具有完整头孢菌素结构的聚合物，质谱分析中3位侧链断裂易产生A3碎片；而如果出现A2碎片，提示其可能是与3位侧链的聚合产物；通过分析聚合物是否存在差向异构体亦可帮助判断聚合反应位点。当质谱裂解途径分析不能推断出聚合物的最可能结构时，应通过聚合物对照品进行确认。

3 其他结构的头孢菌素

头孢西丁钠、头孢呋辛钠等结构中存在氨甲酰结构的头孢菌素，理论上它们应当与其他头孢菌素具有相似的聚合反应途径，但采用柱切换-LC/MS技术分析头孢西丁钠强制聚合溶液中的聚合物时，虽然发现其中存在多个聚合物杂质(图9)，但均无法依据头孢菌素的已知聚合反应途径(母核羧基的反应或3位侧链中氨甲酰结构中氨基的反应)推测出可能结构，且在实际产品中也未检测到聚合物杂质[11]。对头孢呋辛钠水溶液降解杂质的分析显示，其3位侧链水解可形成去氨甲酰头孢呋辛，去氨甲酰头孢呋辛3位侧链的羟基可以被氨基取代，进一步形成3位具有伯氨基结构的降解物[15]，在对头孢西丁钠杂质谱的分析中亦发现相似的降解物[16]。由于伯氨基在头孢菌素的聚合反应中是最重要的聚合反应位点[4-5,12]，使得该类头孢菌素的聚合反应变得更加复杂。文献[11]强制聚合反应介质为水溶液，因而其观测到聚合物杂质更可能与头孢西丁降解物参与的聚合反应有关。对该类头孢菌素聚合物解析需要进一步研究。

4 总结

7位侧链含有伯氨基结构的头孢菌素，侧链氨基攻击另一分子的β-内酰胺环是主要的聚合反应途径；该类头孢菌素在水溶液中强制聚合，通常仅能形成二聚体，在非水溶液中聚合可以形成多聚体；推测该类头孢菌素的聚合物结构：首先根据反应机理推测可能的结构，再利用质谱裂解规律对所推测的结构进行验证，必要时通过高分辨质谱对其结构进行再确证。

7位侧链不含伯氨基结构的头孢菌素主要通过母核羧基攻击另一分子的β-内酰胺环或3位侧链进行聚合，二者的区别在于前者可形成一对差向异构体；对该类头孢菌素进行强制聚合时宜采用高湿环境固态聚合的方法，在水溶液中通常不易形成聚合物。不同品种究竟易通过何种聚合反应途径进行聚合目前没有较明确的结论；利用质谱裂解规律有时无法判断聚合物的具体聚合位点，因而采用反合成方法获得聚合物对照品是确证该类头孢菌素聚合物结构的理想方法。由于该类头孢菌素的3位侧链易水解，由羧基与β-内酰胺环形成的聚合物理论上可形成3种侧链水解物，羧基与3位侧链环形成的聚合物仅能形成1种水解物，利用该特性通过对聚合物水解物的发现也可以帮助判断二类聚合物。

对部分头孢菌素如头孢西丁钠等，按目前已知的聚合反应机理尚不能完全解释其聚合反应途径，但该类头孢菌素实际样品中的聚合物含量均较低，提示相对于其他头孢菌素，它们不易发生聚合反应。