阿奇霉素及其杂质J对斑马鱼毒性的转录组学分析

陈宁 黄权华 苏军权 张苗青,2 张靖溥

(1 深圳华润九新药业有限公司，深圳 518049；2 中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所，国家卫生健康委员会抗生素生物工程重点实验室，抗感染药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

阿奇霉素(azithromycin)是一种由红霉素结构修饰得到的第二代大环内酯类抗生素，在临床上广泛应用于呼吸道感染或皮肤和软组织感染等[1-2]。张斗胜等对不同盐形式的国产注射用阿奇霉素中杂质谱进行考察，发现酸降解物3'-去克拉定糖阿奇霉素(杂质J)为主要降解产物[3-4]。由于阿奇霉素的C9位羰基被修饰，不能发生缩酮化反应，因此与红霉素相比，对酸更稳定[5]。但口服阿奇霉素片剂在胃液中释放后能被迅速水解成杂质J，而阿奇霉素肠溶胶囊可较好地解决阿奇霉素在体内产生杂质J这一问题[6-7]。为揭示杂质J可能诱发的毒副作用及其机制，为临床更好地应用阿奇霉素制剂提供选择依据，本文利用模式动物斑马鱼通过转录组学分析，探讨阿奇霉素及杂质J的可能毒性作用及差异。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

斑马鱼(Danio rerio)野生型AB系，饲养方法和受精卵收集参照文献[8]。本研究中选用发育正常的3 dpf(3 day post fertilization)斑马鱼幼鱼用于后续实验。本实验程序符合中国医学科学院医药生物技术研究所的动物实验伦理规则，并获得所实验动物管理委员会的准许。

1.1.2 试剂

阿奇霉素(批号130352-201808)和阿奇霉素杂质J(批号130650-200901)标准品由中国食品药品检定研究院馈赠，纯度为95%。Trizol试剂和二甲亚砜(DMSO)自Invitrogen公司购买。

1.2 方法

1.2.1 LD5和LD50测定

参照文献[8-9]的方法，发育正常的3 dpf斑马鱼幼鱼分别给与不同浓度的阿奇霉素和杂质J(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)，每组各30条。给药3 d后，统计不同浓度的两种化合物导致的斑马鱼幼鱼死亡数，计算死亡率(%)，绘制“致死率-浓度”效应曲线，并计算阿奇霉素和杂质J对斑马鱼幼鱼整体毒性的LD5和LD50值。

1.2.2 转录组学分析

参照文献[10]的方法，3 dpf野生型斑马鱼幼鱼置于相同浓度的阿奇霉素和杂质J (2 mmol/L)药液中，每组各20条，培养3 d后，Trizol法提取总 RNA，转录组测序及原始数据分析由北京博奥生物科技有限公司完成。将P＜0.05显著差异的转录本进行GO富集分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR

参照文献[8-9]的方法，斑马鱼幼鱼(3 dpf)分别给与不同浓度的阿奇霉素和杂质J (0.5、1和2 mmol/L)，每组各20条，给药3 d后，Trizol法提取组织总RNA，利用LightCycler 480荧光实时定量PCR仪进行扩增，以β-actin为内参基因，基因相对mRNA表达量用2-ΔΔCt方法计算。所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers used in the qRT-PCR analysis

1.3 统计学分析

除RNA-seq分析外，所有实验均重复3次，所有数据均以(x_±s)表示，GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析并制图。t检验分析组间差异，P＜0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 阿奇霉素和杂质J对斑马鱼幼鱼的整体毒性

3 dpf斑马鱼幼鱼分别置于不同浓度的阿奇霉素和杂质J溶液(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)中培养，3 d后，统计每组斑马鱼幼鱼死亡率，绘制两种化合物的致死率-浓度曲线(图1)，计算出阿奇霉素对斑马鱼幼鱼的LD5和LD50，分别为0.71 mmol/L和3.10 mmol/L，杂质J的LD5和LD50分别为0.68 mmol/L和3.16 mmol/L，结果表明阿奇霉素和杂质J对斑马鱼幼鱼整体毒性没有显著差异。

2.2 差异基因表达分析

利用转录组学分析(RNA-seq)进一步揭示阿奇霉素和杂质J对斑马鱼的毒性反应机制，结果表明，两种化合物在转录水平均可导致幼鱼的基因表达谱发生明显改变，且二者导致发生显著性变化的基因个数不同，与对照组相比，阿奇霉素导致了1257个基因发生显著性变化，其中上调基因有797个，下调基因有460个，杂质J导致了1190个DEGs，其中上调基因有688个，下调基因有502个(图2A)。去除未知基因后，阿奇霉素与杂质J共同调节的差异基因个数为49个，阿奇霉素单独调节26个DEGs，杂质J单独调节21个DEGs(图2B)。提示二者可能通过影响体内不同的生理过程导致毒性反应的发生。

2.3 差异基因GO归类分析

进一步对两种化合物调节的DEGs通过基因本体(GO)数据库进行功能归类分析(图3)。阿奇霉素调节的DEGs归类到GO生物过程(变化倍数＞3，P＜0.05)分别为碳水化合物代谢过程(carbohydrate metabolic process)、海藻糖代谢过程(fucose metabolic process)、碳水化合物衍生物分解代谢过程(carbohydrate derivative catabolic process)、糖脂分解代谢过程(glycolipid catabolic process)和TOR信号通路的正调控(positive regulation of TOR signaling)等。杂质J调节的DEGs归类到GO生物过程分别为碳水化合物代谢过程(carbohydrate metabolic process)、免疫反应(immune response)、碳水化合物衍生物分解代谢过程(carbohydrate derivative catabolic process)、小分子代谢过程(small molecule metabolic process)和氨基糖代谢过程(amino sugar metabolic process)等。上述阿奇霉素单独调节的26个DEGs中有4个基因归属于显著差异性GO生物过程(变化倍数＞3，P＜0.05)，其中ctsc、gnpda和gck基因归属于碳水化合物及碳水化合物衍生物等代谢过程，tmem127基因归属于TOR信号相关生物过程，与细胞生长密切相关。杂质J单独调节的21个DEGs中只有1个基因(cxcl8b.1基因)归属于显著差异性GO生物过程(变化倍数＞3，P＜0.05)，属于免疫反应相关生物过程。阿奇霉素单独调节的4种DEGs中ctsc和gnpda基因显著上调，而gck和tmem127基因显著下调；杂质J单独调节的cxcl8b.1基因显著上调。上述结果提示阿奇霉素和杂质J均可能影响机体的代谢过程，而杂质J还可能会影响机体的免疫反应过程。

2.4 qRT- PCR分析

为验证上述RNA-seq检测结果，利用qRT-PCR对阿奇霉素和杂质J可单独调节的差异基因进行检测。结果表明阿奇霉素可单独调节的ctsc、gnpda、gck和tmem127基因以及杂质J可单独调节的cxcl8b.1基因表达变化与RNA-seq测序结果相似，并呈浓度依赖性(图4)。

3 讨论

阿奇霉素的主要酸降解产物是杂质J，本研究利用模式动物斑马鱼分析阿奇霉素及其杂质J在体内毒性反应的异同。两种化合物对斑马鱼幼鱼的急性毒性反应没有显著性差异；但转录组学分析发现，阿奇霉素可单独调节ctsc、gnpda、gck和tmem127基因，它们与体内的生物代谢与细胞生长(TOR信号相关的生物过程)过程有关；而杂质J可单独调节cxcl8b.1基因，与体内免疫反应过程相关；提示二者在体内导致的生理反应并不完全相同。

cxcl8b.1基因编码的interleukin-8b.1蛋白是促炎症因子，该基因高表达可使机体炎症途经被激活，进而可能诱导炎症特征性体征，例如肿胀、发热、疼痛、发红和功能丧失等[11-12]。目前儿童使用注射用阿奇霉素时会有输注部位疼痛和急性严重过敏反应等不良反应[13]，而国产阿奇霉素片剂在使用过程中更易发生胃肠道反应等不良反应(未发表资料)，这些不良反应的产生是否与杂质J有关仍需进一步的研究。

本文明确了阿奇霉素与杂质J对机体生理过程的影响具有明显差异，为深入探讨阿奇霉素不同剂型-杂质-不良反应的关系提供了研究方向，对阿奇霉素产品的质量控制和制剂的临床应用均具有重要意义。