氯胺酮减轻大鼠脊髓缺血/再灌注损伤

陈 勇，庞红利，许远征，毛珊珊，洪道先

(河南大学第一附属医院 麻醉与围术期医学科， 河南 开封 475001)

脊髓缺血/再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII)具有二次损伤的特点，及时实施神经保护干预是改善SCII预后的关键[1]。氯胺酮(ketamine) 是一种非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，已被证实可通过调控相关通路、减轻炎性反应在小鼠脑缺血再灌注损伤中发挥神经保护作用[2]，但其对SCII的作用及其机制如何目前尚不清楚。胞外调控蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)1/2信号通路已被证实参与包括SCII在内的多种器官的缺血/再灌注损伤过程[3-4]，因此，本研究拟探讨不同剂量氯胺酮对SCII的作用及ERK1/2信号通路的影响，为SCII的预后改善措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

SPF级雄性SD大鼠32只，体质量(300±15)g[河南省实验动物中心，动物检疫许可证号：SYXK(豫)2017-0001]。盐酸氯胺酮注射液(福建古田药业有限公司)；兔抗ERK1/2单克隆抗体、兔抗大鼠p-ERK1/2单克隆抗体和山羊抗兔IgG(Invitrogen公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物的分组处理：大鼠分为假手术组(S组)、SCII组、ketamine-L和ketamine-H组，每组8只。采用Zivin法[5]建立大鼠SCII模型：禁食不禁水8 h，腹腔注射1%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，取仰卧位固定，沿腹正中偏左向下切开3 cm，暴露并分离腹主动脉，动脉夹夹闭45 min后松开。待检查无出血，缝合伤口并涂抹红霉素软膏，并连续3 d腹腔注射硫酸庆大霉素液0.1 mg。S组大鼠行相同手术但不做夹闭处理。再灌注术后1 d，ketamine-L和ketamine-H组分别腹腔注射50和100 mg/(kg·d)氯胺酮，连续14 d；S和SCII组注射等体积0.9% NaCl溶液。本研究已经河南大学第一附属医院伦理委员会批准通过(批准号：2020-0603)。

1.2.2 神经行为学评分：采用改良Tarlov评分[6]评定大鼠后肢运动功能(表1)，术后6 h评分0～4分为造模成功。记录各组大鼠再灌注后1、3、7和14 d的神经行为学评分结果。

1.2.3 Nissl染色观察脊髓组织：14 d后断头处死

表1 改良Tarlov评分标准Table 1 Modified Tarlov criteria

大鼠，分离腰椎L3～L5节段脊髓，其中L4～L5节段置于-80 ℃冰箱中保存，L3～L4节石蜡包埋后切片。取组织石蜡切片常规脱蜡、水化后，用甲基紫染色液于56 ℃染色1 h，冲洗后用Nissl Differentiation(尼氏分化液)分化1～3 min，无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜下观察神经元并计数。

1.2.4 TUNEL法检测脊髓神经元凋亡率：取组织石蜡切片脱蜡复水，漂洗后滴加蛋白酶K修复液，37 ℃孵育30 min，3% H2O2去内源性杂质，清洗后滴加TUNEL反应液，37 ℃孵育2 h，滴加3% BSA室温下封闭30 min；滴加DAB显色，DAPI复染，封片后荧光镜下观察并采集图像。计算脊髓前角细胞凋亡率：凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 ELISA法检测脊髓组织炎性因子：取大鼠脊髓组织，匀浆，3 000 r/min离心15 min后取上清，按照ELISA试剂盒检测白细胞介素-1β(interleukin-1 β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-1，IL-6)及血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)水平。

1.2.6 脊髓组织氧化应激指标的检测：取上述脊髓组织上清液检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量、谷胱甘肽-过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)活性及髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，严格按照相应试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 蛋白免疫印迹法检测Erk1/2信号通路相关蛋白表达：取冻存脊髓组织加入200 μL RIPA缓冲液磨成匀浆，室温孵育2 min，4 ℃ 14 000～16 000×g离心2 min，收集上清，提取脊髓组织总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。随后进行电泳、转膜、封闭后滴加一抗ERK1/2、p-ERK1/2，4 ℃孵育过夜后加二抗孵育1.5 h。ECL曝光成像，Image J定量分析蛋白相对表达量：目的条带与内参β-actin的吸光度比值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠后肢运动学评分比较

与S组相比，再灌注1 d后SCII组大鼠后肢评分均显著降低(P<0.05)，提示造模成功；与SCII组相比，再灌注3 d后ketamine-L和ketamine-H组评分均显著升高(P<0.05)(图1)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group图1 各组大鼠后肢运动功能改良Tarlov评分分析Fig 1 Modified Tarlov score analysis of hind limb motor function of rats in each group

2.2 Nissl染色分析

与S组相比，SCII组阳性神经细胞数目显著减少(P<0.05)；与SCII组相比，ketamine-L和ketamine-H组阳性细胞数目均明显增加(P<0.05)(图2)。

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group图2 各组脊髓组织Nissl染色分析Fig 2 Nissl staining analysis of spinal cord tissue in each

2.3 TUNEL法检测细胞凋亡率

与S组相比，SCII组细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与SCII组相比，ketamine-L和ketamine-H组细胞凋亡率均显著下降(P<0.05)(图3，表2)。

表2 各组细胞凋亡率比较分析

2.4 脊髓组织炎性因子水平变化

与S组相比，SCII组IL-1β、TNF-α、IL-6及VCAM-1水平均显著升高(P<0.05)；与SCII组相比，ketamine-L和ketamine-H组各因子水平均显著下降(P<0.05)(表3)。

2.5 氧化应激相关指标变化

与S组相比，SCII组SOD和GPX水平明显降低，MDA、MPO水平显著升高(P<0.05)；与SCII组相比，ketamine-L和ketamine-H组SOD和GPX水平明显升高，MDA、MPO水平显著降低(P<0.05)(表4)。

2.6 Erk1/2信号通路相关蛋白表达

与S组相比，SCII组p-ERK1/2及p-ERK1/2/ERK1/2值均明显升高(P<0.05)；与SCII组相比，ketamine-H和ketamine-L组回降(P<0.05)(图4)。

图3 TUNEL法检测各组大鼠脊髓组织细胞凋亡情况Fig 3 Apoptosis of spinal cord tissue cells in each group was detected by TUNEL method (×200)

表3 各组脊髓组织炎性因子水平变化Table 3 Changes of inflammatory cytokines in spinal cord tissue in each

表4 各组脊髓组织氧化应激相关指标变化Table 4 Changes of indexes related to oxidative stress in spinal cord tissue in each

*P<0.05 compared with S group; #P<0.05 compared with SCII group图4 ERK1/2信号通路相关蛋白的表达Fig 4 Expression of ERK1/2 signaling pathway related proteins

3 讨论

研究表明SCII的发生涉及多种机制，病理过程可能与神经元变性、细胞凋亡和ERK1/2等信号通路的激活密切有关，且常伴有细胞内外离子紊乱、炎性反应、氧化应激及氧自由基增多等[7]。本研究中SCII大鼠Tarlov评分、阳性神经元数目及SOD和GPX水平显著降低，凋亡率、炎性因子及MDA、MPO水平显著升高，进一步验证了现有研究结果。因此推测，抑制炎性反应、氧化应激反应、阻止神经细胞损害和凋亡，是改善SCII病情的关键。

氯胺酮是一种临床广泛应用的苯环已哌啶类静脉麻醉剂。近年来，有研究表明[8]氯胺酮除麻醉作用外，还具有一定的抗感染和神经保护作用，可减轻多种器官的缺血再灌注损伤程度。如抑制心肌缺血再灌注细胞中Toll样受体4(TLR4)和NF-κB的表达，减轻细胞损伤、发挥神经保护作用[9]；抑制NF-κB并激活Akt/mTOR信号通路，降低肺缺血再灌注损伤大鼠肺组织细胞凋亡率、炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平及MDA含量和MPO活性，提高SOD活性[10]；提高脑缺血再灌注小鼠神经行为学评分，降低细胞凋亡率和炎性反应，影响NF-κB信号通路减轻损伤程度[11]。但目前关于氯胺酮与SCII作用关系的研究报道极少。为明确二者的作用关系，本研究检测不同剂量氯胺酮处理的SCII大鼠的脊髓细胞凋亡、炎性及氧化应激反应，评估Tarlov，结果发现氯胺酮处理的SCII大鼠Tarlov评分均显著升高，神经元阳性细胞数及SOD和GPX活性增高，细胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6、VCAM-1水平及MDA含量、MPO活性显著降低，提示氯胺酮可减轻SCII程度，且低剂量效果更优。此外，氯胺酮可通过抑制ERK1/2信号通路减轻神经炎性反应，改善抑郁大鼠的行为学表现[12]。但氯胺酮在SCII中对神经细胞的保护作用是否与ERK1/2信号通路有关目前尚无明确报道，而本研究中发现SCII大鼠p-ERK1/2、p-ERK1/p-ERK2和ERK1/ERK2明显升高，氯胺酮处理后ERK1/2磷酸化水平回降，且低剂量回降幅度大于高剂量。

综上所述，低剂量氯胺酮可减轻SCII程度，且ERK1/2信号通路可能参与该过程，但尚需后续更多的研究进一步证实。