醛糖还原酶抑制剂抑制屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞系BEAS-2氧化应激反应

鲍 敏，林 玫，甄海宁，何 芳，丁 敏，袁竹青，陈亚隽，薛欣欣

(武汉市第三医院 呼吸与危重症医学科，湖北 武汉 430060)

支气管哮喘(bronchial asthma)是一种以可逆性的气道痉挛、气道高原反应等为特点的气道慢性炎性反应疾病[1]。气道上皮细胞是气道的首要防线，可有效的抵御外界刺激，多种证据表明其在哮喘气道炎性的启动和维持中发挥关键作用[2]。有研究发现，阻断或减弱醛糖还原酶(aldose reductase，AR)活性可缓解细胞功能损伤，目前醛糖还原酶抑制剂(aldose reductase inhibitors，ARIs)的研究已经取得一定成效[3]，中药醛糖还原酶抑制剂分为多种，其中恼火黄酮类、生物碱类等，其因来源广、副作用小的特点被广泛应用，目前临床用于治疗糖尿病并发症疾病，疗效确切[4]，但ARIs对支气管上皮细胞的作用机制研究较少。本研究探究醛糖还原酶抑制剂对屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞氧化应激反应的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：人支气管上皮细胞系BEAS-2B(ATCC公司)。

1.1.2 试剂：RPMI 1640培养基、胎牛血清(Invitrogen公司)；醛糖还原酶抑制剂(Pfizer公司)；地塞米松(Sigma Aldrich公司)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxidedis-mutase，SOD)检测试剂盒(均购于中国碧云天生物技术研究所)；NF-κB抗体、p38 MAPK抗体(Cell Signal Technology公司)；屋尘螨(北京博蕾德生物科技有限公司)；NF-κB抑制剂PDTC(北京白奥莱博科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理：将BEAS-2B细胞分为对照组，模型组(屋尘螨50 μmol/L刺激)，NF-κB抑制剂(PDTC)组(PDTC干预模型组，10 μmol/L)，ARIs组(ARIs干预模型组，50 μmol/L)。

1.2.2 细胞中SOD活性和MDA含量的测定：将BEAS-2B细胞浓度调整为1×106个/L，检测细胞中氧化应激指标MDA含量和SOD活性。

1.2.3 细胞中ROS含量的测定：将BEAS-2B细胞浓度调整为1×106个/L，加入终浓度10 μmol/L的活性氧荧光黄探针(DCFH-DA)，置于细胞于避光环境中，孵育30 min后，用PBS溶液洗涤，最后用流式细胞仪检测荧光强度，来反应ROS含量。

1.2.4 ELISA检测细胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量：用无菌离心管收集培养24 h后的细胞培养液，2 000 r/min离心20 min，收集上清液。ELISA检测IL-5、IL-13、IFN-γ含量。

1.2.5 MTT法测定细胞存活率：取对数期的BEAS-2B细胞，按1×106个接种于96孔板中，100 μL/孔，将孔板置于培养箱中，培养细胞过夜，各组细胞的孔板内分别加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，用无血清的培养基避光孵育细胞4 h，弃掉上层血清，将二甲基亚砜溶液MTT再次加入到培养基中，对细胞在490 nm处的吸光度值进行测定，对细胞的存活率进行计算。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：取对数期的各组BEAS-2B细胞，将细胞浓度调整为3×106个/L。用胰蛋白酶消化孔板内的细胞，离心细胞，5 min后弃掉细胞上清液，加入annexin V-FITC和PI于细胞中，避光孵育制成的细胞悬液，15 min后向每个流式管中加入400 μL上样缓冲液，让细胞充分混匀，上机检测。

1.2.7 蛋白质印迹检测细胞内NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达：取对数期的各组BEAS-2B细胞加入胰蛋白酶消化细胞并离心，弃掉上清液后用PBS溶液重悬细胞，再次离心后裂解滑膜成纤维样细胞，离心15 min后收集上清液并测定总蛋白含量。取30 μg蛋白上样煮沸、电泳、PVDF膜转印。封闭组织后加入一抗和二抗，充分混匀后孵育5 min，GABA一抗稀释液加入到组织中，充分混匀后转至PVDF膜上，显色后测定蛋白的相对吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞中SOD活性和MDA含量比较

模型组BEAS-2B细胞中SOD活性低于对照组，MDA含量高于对照组(P<0.05)；和模型组相比，PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞中SOD活性均升高，MDA含量均显著降低(P<0.05)(表1)。

2.2 各组细胞中ROS含量比较

模型组BEAS-2B细胞中ROS含量较对照组明显增加(P<0.05)；PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞中ROS含量较模型组明显减少(P<0.05)(图1)。

表1 各组SOD活性、MDA含量比较

2.3 各组细胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比较

模型组BEAS-2B细胞中IL-5、IL-13含量显著高于对照组细胞，IFN-γ含量较对照组显著降低(P<0.05)；PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞中IL-5、IL-13含量明显低于模型组，IFN-γ含量高于模型组(P<0.05)(表2)。

A.fluorescence detection of ROS content in each group; B.comparison of ROS content in each group *P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

表2 各组细胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比较

2.4 各组细胞存活率比较

模型组BEAS-2B细胞存活率低于对照组(P<0.05)；PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞存活率均明显高于模型组(P<0.05)(图2)。

2.5 各组细胞凋亡率比较

和对照组相比，模型组BEAS-2B细胞凋亡率明显增加(P<0.05)；和模型组相比，PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞凋亡率均显著降低(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 comparedwith model group图2 各组细胞存活率比较Fig 2 Comparison of cell survival rate in each group

2.6 各组细胞中NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达比较

和对照组相比，模型组BEAS-2B细胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达均显著增加(P<0.05)；和模型组相比，PDTC组和ARIs组BEAS-2B细胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表达均明显降低(P<0.05)(图4)。

3 讨论

支气管哮喘是一种异质性疾病[5]。研究发现，机体内产生的大量活性氧会导致气道发生炎性反应，气道高反应性和气道重塑等[6-7]。研究证实，抑制哮喘大鼠中活性氧的生成，可减少嗜酸粒细胞的产生，抑制气道免疫炎性反应[8]。可见支气管哮喘存在氧化/抗氧化失衡现象，影响病理学改变。

SOD是抗氧化酶的一种，可清除细胞代谢过程中所产生的氧自由基，降低活性氧水平，保护支气管。MDA是膜脂过氧化反应的产物之一，蓄积过多的氧化产物，导致蛋白质等大分子相互交联，加重组织损伤[9]。本研究结果显示，ARIs组细胞中SOD活性可降低MDA和ROS含量，提示醛糖还原酶抑制剂可改善屋尘螨诱导的支气管上皮细胞中的氧化应激反应。近年来研究显示，醛糖还原酶介导支气管哮喘炎性反应的病理过程，可通过抑制炎性细胞因子和活性氧等抑制醛糖还原酶的活性，进而降低气道发生的炎性反应和高反应性，对哮喘病理过程的进展有很好的疗效[0]。

有研究发现，支气管哮喘的发生通常被认为是辅助性T细胞介导的病原体所致炎性细胞浸润而诱发[11]。其中Th1/Th2协调的不平衡是导致气道高反应性发生的关键原因。IFN-γ为Th1的特征因子，IL-5、IL-13为Th2分泌的炎性因子[12]。本研究结果显示，ARIs组细胞中IL-5、IL-13含量减少，IFN-γ含量增加，提示醛糖还原酶抑制剂可抑制屋尘螨刺激的支气管上皮细胞中的炎性因子。醛糖还原酶(AR)可介导糖尿病慢性并发症的发生，AR抑制剂(ARIs)可影响高糖诱导的视网膜病变，并且ARIs在临床上长期使用的副作用也较小。动物实验发现[13]AR介导哮喘炎性的发生发展，ARIs可抑制气道上皮细胞内炎性因子的产生和聚集，同时抑制氧化应激反应以及气道上皮细胞转变为黏液分泌细胞，进而减少哮喘发生时的炎性反应，因此ARIs成为防治哮喘的新方向。

支气管哮喘的肺部炎性机制与复杂的网络传导有着不可分割的联系，其中NF-κB相关通路与p38 MAPK是导致支气管哮喘整个发病过程的重要传导机制，与哮喘等免疫和炎性反应有明显相关性[14]。在正常情况下，NF-κB 稳定存在于细胞质中，当细胞激活后，p38 MAPK发生磷酸化降解，导致NF-κB核定位序列的暴露，进而进入细胞核内与目的基因特异性结合位点结合，促进包括IL-5和IL-13等目的基因的转录，提示了NF-κB和MAPK是治疗支气管哮喘的潜在靶点。本研究结果显示，ARIs组细胞中NF-κB、NF-κB p65与p38 MAPK蛋白表达减少。研究证实，给予哮喘大鼠姜黄素干预，结果显示干预组大鼠支气管中多种炎性细胞数、IL-4、IL-5含量降低，浸润的炎性细胞计数减少，其作用机制与调控NF-κB p65核转位及磷酸化MAPK蛋白水平有关[15]。

A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.comparison of apoptosis rates in each group；*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group

A.expression of NF-κB, NF-κB P65 and p38 MAPK protein in each group; B.comparison of NF-κB protein expression in each group (n=6); C.comparison of NF-κB p65 protein expression in all groups (n=6); D.comparison of p38 MAPK protein expression in each group (n=6)；*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

综上所述，醛糖还原酶抑制剂可抑制屋尘螨诱导的人气道上皮细胞发生的氧化应激反应，促进BEAS-2B细胞增殖，抑制凋亡。