丙泊酚减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

陈 思，杨富国，彭红军，曹卫乐，王振宇

(中国人民解放军联勤保障部队第991医院 麻醉科， 湖北 襄阳 441000)

缺血性心脏病是临床上常见的心血管疾病，主要是因为冠状动脉狭窄或闭塞引起的心脏病，是导致心血管疾病死亡的主要原因之一[1]，对人类健康和生活带来不便，因此，如何有效的减缓或避免心肌缺血/再灌注损伤引起的心血管疾病是当前临床上急需解决的问题。丙泊酚(Propofol, Pro)是一种短效的静脉麻醉药，化学名为2,6-二异丙基苯酚(2,6-Diisopropylphenol)，具有起效快、毒副作用少、苏醒快等特点，在心脏、肝脏和肾脏等器官上具有保护作用[2-3]。Pro通过激活PI3K/Akt信号通路减缓缺氧/复氧诱导乳鼠心肌的凋亡[4]。c-Jun氨基末端激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(JNK/p38 MAPK)通路在缺氧/复氧诱导的心肌细胞中高表达，抑制JNK/p38 MAPK可以减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激，并促进细胞的活力[5]。因此，本研究通过诱导建立心肌细胞的缺氧/复氧模型，探讨Pro是否可以通过调控JNK/p38 MAPK通路发挥在缺氧/复氧诱导的心肌细胞的作用，以及相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

大鼠心肌细胞系H9c2(北京北纳创联生物公司)；胎牛血清、高糖DMEM培养基(上海江林生物公司)；丙泊酚注射液(西安力邦制药公司)；p38 MAPK通路抑制剂SB203580(Sigma Adrich公司)；MTT试剂盒、凋亡试剂盒(上海碧云天生物公司)；Bcl-2抗体、Bax抗体、cleaved caspase-3抗体、p-JNK抗体、p-p38 MAPK抗体、JNK抗体、p38 MAPK抗体和GAPDH抗体(北京中杉金桥生物公司)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒、丙二醛(malondia dehyde,MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒和过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒(南京建成生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:将对数期心肌细胞H9c2分为对照(control)组；缺氧/复氧(A/R)组：在95% N2、5% CO2进行缺氧处理3 h，在37 ℃、5% CO2的条件下进行复氧培养6 h；缺氧/复氧+Pro低、中、高剂量(A/R+Pro-L、A/R+Pro-M、A/R+Pro-H)组：将Pro分别为12.5、25、50 μmol/L时添加在心肌细胞H9c2内，然后进行缺氧/复氧处理；缺氧/复氧+Pro+p38 MAPK通路抑制剂(A/R+Pro+SB203580)组：将Pro浓度为50 μmol/L和p38 MAPK通路抑制剂SB203580浓度为15 μmol/L添加在心肌细胞H9c2内，然后进行缺氧/复氧处理。

1.2.2 流式细胞测量术检测细胞凋亡：收集各组心肌细胞H9c2，将细胞(1×106个/mL)接种至6孔板内。严格按照凋亡试剂盒说明书的指示，加入相应的缓冲液重悬细胞后，加入5 μL annexin V-FITC和PI混匀，遮光反应15 min，置于流式细胞仪检测细胞的凋亡。

1.2.3 Weatern blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和JNK/p38 MAPK通路相关蛋白的表达:收集各组心肌细胞H9c2，加入RIPA蛋白裂解液用于提取细胞的总蛋白。在100 ℃沸水变性10 min，取上样蛋白在10%的SDS-PAGE进行分离，经转膜，封闭处理1.5 h，加入稀释的Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-JNK、p-p38 MAPK、JNK、p38 MAPK和GAPDH抗体，4 ℃过夜孵育，加入二抗，室温下孵育1.5 h，滴加化学发光液，显影。以GAPDH为内参，分析蛋白的表达。

1.2.4 ELISA检测LDH活性、MDA含量、SOD活性和CAT活性:收集各组心肌细胞H9C2，离心后去细胞的上清液，参照LDH试剂盒、MDA试剂盒、SOD试剂盒和CAT试剂盒说明书的步骤，检测LDH活性、MDA含量、SOD活性、CAT活性。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和蛋白表达的影响

与control组相比，A/R组的细胞Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达明显增加(P<0.05)；与A/R组相比，A/R+Pro-L组、A/R+Pro-M组、A/R+Pro-H组的细胞Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)，细胞凋亡率、Bax、cleavedpase cas-3蛋白表达明显降低(P<0.05)(图1，表1)。

2.2 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响

与control组相比，A/R组的LDH、MDA明显增加(P<0.05)，SOD、CAT明显降低(P<0.05)；与A/R组相比，A/R+Pro-L组、A/R+Pro-M组、A/R+Pro-H组的LDH、MDA明显降低(P<0.05)，SOD、CAT明显增加(P<0.05)(表2)。

A.apoptosis rate; B.apoptosis-related protein图1 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和蛋白表达的影响Fig 1 Effect of propofol on cardiomyocyte apoptosis and protein expression induced by anoxia-reoxygenation

表1 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和蛋白表达的影响

表2 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响Table 2 Effect of propofol on the oxidative stress of cardiomyocytes induced by anoxia-reoxygenation

2.3 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞JNK/p38 MAPK通路的影响

与control组相比，A/R组的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达明显增加(P<0.05)； 与A/R组相比A/R+Pro-L组、A/R+Pro-M组、A/R+Pro-H组的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达明显降低(P<0.05)(图2，表3)。

图2 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞JNK/p38 MAPK通路的影响Fig 2 Effect of propofol on the JNK/p38 MAPK pathway of cardiomyocytes induced by anoxia-reoxygenation

2.4 加入JNK/p38 MAPK通路抑制剂对JNK、p38 MAPK蛋白的影响

与A/R+Pro组相比， A/R+Pro+SB203580组p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达明显降低(P<0.05)(图3，表4)。

2.5 Pro通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

与A/R+Pro组相比， A/R+Pro+SB203580组的细胞Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)， 细胞凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达明显降低(P<0.05)(图4，表5)。

图3 加入JNK/p38 MAPK通路抑制剂对JNK、p38 MAPK蛋白的影响Fig 3 Effect of JNK/p38 MAPK pathway inhibitor on JNK and p38 MAPK proteins

表3 Pro对缺氧/复氧诱导的心肌细胞JNK/p38 MAPK通路的影响

2.6 Pro通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响

与A/R+Pro组相比，A/R+Pro+SB203580组的LDH、MDA含量明显降低(P<0.05)，SOD、CAT活性明显增加(P<0.05)(表6)。

3 讨论

Pro是临床上广泛使用的一种烷基类麻醉剂，对心肌细胞的损伤有保护作用，具有抗凋亡、抗氧化的作用[6-7]。Pro可以抑制过氧化氢诱导的心肌细胞的凋亡和氧化应激[8]。Pro通过激活ERK1/2通路抑制过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡、氧化应激[9]。Pro通过调控Sirt1/FoxO1通路减缓氯化钴诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤，促进其细胞增殖[10]。本研究结果显示，缺氧复氧组的细胞SOD、CAT活性受到抑制，促进心肌细胞的凋亡率、增加LDH、MDA含量，下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax、cleaved caspase-3蛋白表达，这表明模型构建成功。经过Pro处理细胞后，Pro各剂量组能够促进缺氧/复氧诱导心肌细胞的SOD、CAT活性，抑制心肌的凋亡率、减少LDH、MDA含量，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax、cleaved caspase-3蛋白表达，这说明Pro可以减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。

表4 加入JNK/p38 MAPK通路抑制剂对JNK、p38 MAPK蛋白的影响Table 4 Effect of JNK/p38 MAPK pathway inhibitor on JNK and p38 MAPK proteins

A.apoptosis rate; B.apoptosis-related protein图4 Pro通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

表5 Pro通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡的影响

表6 Pro通过调控JNK/p38 MAPK通路对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化应激的影响

JNK是一种促进分裂原活化的蛋白激酶，属于MAPK家族的成员之一，JNK广泛存在与细胞和组织内，活化的JNK与胚胎发育、细胞增殖及分化、细胞凋亡等过程有关；p38 MAPK也是MAPK家族的成员之一，可以介导细胞凋亡、氧化应激和炎性反应等[11-12]。大量研究结果显示JNK/p38 MAPK通路与心肌缺血/再灌注损伤相关，如ERK、P38的磷酸化水平在心肌缺血/再灌注的肝脏组织中高表达，下调JNK可以减缓缺血/再灌注肝脏损伤的程度[13]。盐酸羟考酮可以减轻异丙肾上腺素诱导的心肌细胞损伤，抑制心肌细胞的凋亡，其作用机制可能与抑制JNK/p38 MAPK通路有关[14]。右美托咪定可以通过抑制p38 MAPK通路促进缺氧/复氧诱导的心肌细胞活力，抑制心肌细胞凋亡和氧化应激[15]。本研究结果显示，缺氧/复氧组的p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达上调，经过Pro处理p-JNK、p-p38 MAPK蛋白表达下调，说明Pro可以调控JNK/p38 MAPK通路的表达。进一步实验加入p38 MAPK通路的抑制剂SB203580后，p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白表达下调，明显增加细胞的SOD、CAT，抑制心肌的凋亡率、LDH、MDA，上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax、cleaved caspase-3蛋白表达，说明Pro可以通过抑制JNK/p38 MAPK通路发挥在缺氧/复氧诱导的心肌细胞的保护作用。

综上所述，Pro可以抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激，这可能与抑制JNK/p38 MAPK通路有关。