培土清热解瘀方对DR 大鼠炎性因子、血管生成及凋亡的影响

姚月蓉，朱蓓菁，钱锦，唐建明

糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一种常见的微血管并发症，也是世界各地劳动年龄人群视力障碍和失明的主要原因[1-2]。而糖尿病黄斑水肿（diabetic macular edema，DME）是DR的重要表现，可出现在DR 的任一阶段。有研究[3-4]表明，培土清热解瘀方（PQJ）能显著增强康柏西普玻璃体注射及激光光凝的治疗效果，改善视力，减轻DME，并降低复发率。但PQJ 对DR 是否具有治疗作用尚不明确。本研究采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）构建DR 大鼠模型，并给予不同剂量的PQJ 药液进行灌胃治疗，分析PQJ 对DR 大鼠血清中炎症细胞因子、视网膜组织中血管生长因子和细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SPF 级SD 大鼠100 只，体重（200±25）g，购于上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。饲养实验室温度18℃～25℃，相对湿度40%～70%。本研究获得上海市宝山区中西医结合医院伦理委员会批准，伦理审批号：201812-04。

1.2 试剂、仪器与药品

肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-6 （interleukin-6，IL-6） 酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 试剂盒（上海信裕生物科技有限公司，XY-E30635、XY-E30646），鼠抗血管内皮生长因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体、鼠抗血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）抗体、鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）抗体（赛默飞世尔科技公司，MA1-16629、PA5-104882、PA5-105271），人抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（美国Abcam 公司，ab49822），苏木素、伊红（珠海贝索生物技术公司，714094、BA4099）。

石蜡切片机 （徕克医疗仪器公司，SQ2125），电泳仪 （美国BIO-RAD 公司，mini protean 3 cell）、电转仪（大连竞迈科技有限公司公司，PS-9），酶标仪（芬兰雷勃公司，MK3）。

PQJ 水煎剂：PQJ 由党参15 g、黄芪30 g、生地30 g、白术10 g、猪苓15 g、茯苓15 g、陈皮10 g、半夏10 g、三七2 g、知母10 g、黄柏10 g、黄芩10 g、黄连5 g、玉米须10 g、甘草5 g 组成。生药购于上海市宝山区中西医结合医院中药房，由雷允上药业集团有限公司提供。取PQJ 生药，加入10 倍量水浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，滤过，药渣加入8 倍量水，煎煮1.5 h，合并2 次所得药液，浓缩（药液与药材比例1∶1），无菌阴干制备成药物浸膏，使用前加入适量体积水溶解成需要浓度。

1.3 DR 大鼠模型建立

选用100 只SD 大鼠适应性喂养7 d 后，随机挑选10 只设为正常对照组（control group，CG），其余大鼠腹腔注射STZ 溶液（60 mg/mL，注射前禁食不禁水16 h），注射后分别于72 h 和每周测定大鼠空腹血糖，连续测量8 周，以血糖值≥16.7 mmol/L 者确定为糖尿病大鼠。根据文献方法[5]，继而用微量进样器抽取0.05 μg 的VEGF，于颞侧角膜缘后2 mm 水平经过睫状体平坦部进入玻璃体腔，缓慢推动进样器留针10 s，4 周后对玻璃体腔注药的大鼠分批行眼底荧光血管造影 （fundus fluorescein angiography，FFA）检查，造影出现背景荧光增强、血管迂曲扩张、新生血管荧光渗漏等表现者为DR 造模成功。

1.4 分组与给药

筛选出造模成功的DR 大鼠40 只，随机分为PQJ 低、中、高剂量组（LPQJ、MPQJ、HPQJ）和模型组（model group，MG），以及模型建立前所设立的CG组，共5 组，每组10 只。HPQJ 组每天灌胃中药液相当于12 倍成人剂量（37.44 g/kg），MPQJ 组为6 倍成人剂量（18.72 g/kg），LPQJ 组为3 倍成人剂量（9.36 g/kg）。CG 组与MG 组每天给予蒸馏水灌胃，每组均连续灌胃3 个月，每日2 次，1 mL/次。

1.5 HE 染色法评价模型和治疗效果

取大鼠眼球壁常温固定24 h，行石蜡包埋切片，常规脱蜡至水，将已入蒸馏水后的切片放入苏木素水溶液中染色5 min，流水冲洗15 min，酒精脱水后伊红染色液染色1～2 min，染色后的切片经纯酒精脱水。二甲苯透明后中性树胶封片，放入65℃烘箱中15 min。通过显微镜拍照，采集分析样本相关部位。

1.6 ELISA 法检测大鼠血清中TNF-α 和IL-6 的含量

收集各组大鼠视网膜组织，使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g 离心10 min 将血清和红细胞迅速小心分离，先加稀释液40 μL，然后再加血清样本10 μL，37℃温育30 min，加入酶标试剂50 μL，温育30 min，洗涤，37℃避光显色15 min，加终止液，测量各孔的吸光度。

1.7 qRT-PCR 检测血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的相对表达量

采用Trizol 法提取视网膜组织RNA，使用DNaseⅠ消除RNA 中的DNA 后，采用逆转录试剂盒制备cDNA，后使用SYBR Green 试剂在ABI Prism 7300仪器上进行PCR 扩增，各基因所用引物序列如表所示（表1）。所得数据采用仪器自带软件进行分析。

表1 引物信息

1.8 Western blot检测VEGF、VEGFR2、Caspase-3和Caspase-9 的相对表达量

提取视网膜组织蛋白，测定蛋白浓度并进行蛋白定量，经凝胶、电泳和转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗 （VEGF、VEGFR2、Caspase-3、Caspase-9 和GAPDH）室温孵育2 h，后将膜冲洗之后加入二抗37°C 孵育1 h，最后采用化学发光显影，以GAPDH 为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学方法

采用SPSS21.0 统计软件对数据进行分析，计量资料数据采用均数±标准差（±s）表示，符合正态分布且方差齐的计量资料，方差分析（ANOVA）进行多组变量间的相互比较，两两比较，采用LSD-t 检验，当P＜0.05 时被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PQJ 对DR 大鼠视网膜形态和血清TNF-α 和IL-6 水平的影响

HE 染色实验显示DR 模型成功建立，同时MPQJ 的视网膜形态接近CG，说明PQJ 可以改善DR（图1）。ELISA 结果显示，5 组间大鼠血清TNF-α和IL-6 水平比较，差异有统计学意义（FTNF-α=10.023，FIL-6=8.920，均P=0.000）。两两比较，（1）TNF-α 表达：与CG 比较，MG 血清TNF-α 升高（t=5.514，P=0.000）；与MG 比较，MPQJ 和HPQJ 血清TNF-α 降低（tMPQJ=3.081，P=0.006；tHPQJ=4.624，P=0.000）；与MPQJ 比较，HPQJ血清TNF-α 降低（t=3.070，P=0.007），差异均有统计学意义。（2）IL-6 表达：与CG 比较，MG 血清IL-6 升高（t=4.998，P=0.000）；与MG 比较，HPQJ 血清IL-6降低（t=4.219，P=0.001），差异均有统计学意义（表2）。

表2 PQJ 对DR 大鼠血清炎性因子和视网膜凋亡因子水平的影响（±s，n=10）

表2 PQJ 对DR 大鼠血清炎性因子和视网膜凋亡因子水平的影响（±s，n=10）

注：* 与CG 相比，P<0.05；# 与MG 相比，P<0.05；PQJ 培土清热解瘀方；DR 糖尿病视网膜病变；TNF-α 肿瘤坏死因子-α；IL-6 白细胞介素-6；Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Caspase-9 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；CG 正常对照组；MG 模型组；LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清热解瘀方低、中、高剂量组

2.2 PQJ 对DR 大鼠视网膜中VEGF 和VEGFR2的mRNA 和蛋白表达的影响

5 组间大鼠视网膜中VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（mRNA：FVEGF=13.559，FVEGFR2=12.969，均P=0.000；蛋白：FVEGF=28.597，FVEGFR2=32.244，均P=0.000）。两两比较，（1）VEGF表达：与CG比较，MG大鼠视网膜VEGF mRNA 表达升高（t=6.598，P=0.000）、VEGF 蛋白表达升高（t=8.391，P=0.000），与MG 比较，MPQJ和HPQJ 大鼠视网膜VEGF mRNA 表达降低（tMPQJ=4.414，tHPQJ=5.084，均P=0.000），HPQJ 组VEGF 蛋白表达降低（t=7.117，P=0.000），差异均有统计学意义。（2）VEGFR2 表达：与CG比较，MG大鼠视网膜VEGFR2 mRNA 表达升高（t=6.378，P=0.000），VEGFR2 蛋白表达升高（t=10.683，P=0.000），差异均有统计学意义。与MG 比较，MPQJ 和HPQJ 大鼠视网膜VEGFR2 mRNA 表达降低（tMPQJ=3.625，P=0.002；tHPQJ=4.228，P=0.000），LPQJ、MPQJ 和HPQJ 组VEGFR2蛋白表达降低（tLPQJ=4.312，tMPQJ=4.656，tHPQJ=7.736，均P=0.000），差异均有统计学意义（表3、图2）。

表3 PQJ 对DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表达的影响（±s，n=10）

表3 PQJ 对DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表达的影响（±s，n=10）

注：* 与CG 相比，P<0.05；# 与MG 相比，P<0.05；PQJ 培土清热解瘀方；DR 糖尿病视网膜病变；VEGF 血管内皮生长因子；VEGFR2血管内皮生长因子受体2；CG 正常对照组；MG 模型组；LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清热解瘀方低、中、高剂量组

2.3 PQJ 对DR 大鼠视网膜Caspase-3 和Caspase-9 表达的影响

5 组间大鼠视网膜Caspase-3 和Caspase-9 的蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（FCaspase-3=48.538，FCaspase-9=51.669，均P=0.000）。两两比较，（1）Caspase-3 表达：与CG 比较，MG 大鼠视网膜Caspase-3 蛋白表达升高（t=12.332，P=0.000）；与MG 比较，HPQJ 大鼠视网膜Caspase-3 蛋白表达降低 （t=7.370，P=0.000），差异均有统计学意义。（2）Caspase-9 表达：MG 大鼠视网膜Caspase-9 蛋白表达升高（t=10.659，P=0.000）；与MG 比较，MPQJ 和HPQJ 大鼠视网膜Caspase-9 蛋白表达量降低（tMPQJ=7.251，tHPQJ=9.161，均P=0.000），差异均有统计学意义（表2、图3）。

3 讨论

DR 是一种以炎症反应和新生血管生成为特征的视网膜微血管病变[6-8]。多种炎症细胞因子如TNFα、IL-6、白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等在糖尿病患者和动物模型的视网膜组织中显著升高，且其浓度随DR 的发展而逐渐增加[7,9]。临床研究[10-11]显示，糖尿病患者房水中IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等炎症细胞因子水平随新生血管的发展逐渐升高，且水平越高则出现视网膜并发症的时间就越早，可见炎症细胞因子在DR 的发病机制中起到一定作用。已有报道[12-14]显示，多种中药能通过抑制炎症细胞因子的水平缓解DR。

中医界较一致地认为DR 是由于糖尿病发病日久，阴虚津亏，不能上承目络，目窍失养；或肝肾阴虚目甚，阴虚阳亢，虚火上炎，灼伤目络而致视物模糊，甚则失明[15]。PQJ 是上海市曙光医院眼科老中医朱炜敏教授多年临床经验方，方以清理三焦内热的基础上，加益气养阴，配以消肿、活血、散瘀药物治疗。用党参、黄芪益气，生地、知母养阴，黄芩、黄连、黄柏清热，白术、茯苓培补脾土，猪苓、茯苓利水消肿，半夏化痰湿，三七活血，甘草调和诸药。与已有动物研究[13,16-17]相一致，本研究中STZ 诱导的DR 大鼠视网膜组织中炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的含量显著增加。而PQJ 灌胃治疗能显著降低DR 大鼠视网膜组织中炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的水平，可见PQJ 能减轻DR 大鼠炎症反应，从而降低视网膜组织的损伤。

临床研究[18]显示，DR 病人随着病情的加重，促血管生成因子VEGF 及其受体水平显著升高。高血糖诱导的糖代谢异常、脂质过氧化、晚期糖基化、谷氨酸毒性和氧化应激诱导视网膜毛细血管细胞凋亡，继而增加VEGF 及其受体VEGFR2 的表达，是糖尿病微血管病变发生的关键因素[19]。STZ 诱导的DR 大鼠在发病后视网膜内血管数增加，VEGF 及其受体VEGFR1 和VEGFR2 的表达增强[13,20-21]。因此，可见VEGF 及其受体参与DR 的发生过程。针对VEGF 或VEGF 受体的治疗物，如Decursin，呈剂量依赖地抑制VEGFR2 的表达，显著抑制糖尿病视网膜新生血管[22]。在人视网膜微血管细胞中沉默硫氧还蛋白互作蛋白 （thioredoxin-interactingprotein，TXNIP）基因，可以通过阻断VEGFR2 抑制VEGF 诱导的血管生成反应[23]。本实验研究证实DR 模型大鼠视网膜组织中VEGF 和VEGFR2 的表达显著高于正常对照组，而PQJ 能明显抑制VEGF 和VEGFR2 的表达，且剂量越高抑制作用越强，说明PQJ能抑制VEGF 和VEGFR2 的水平，可能进一步通过抑制新生血管生成达到改善DR 的目的。

视网膜血管周细胞凋亡是公认的DR 最早的改变。高血压状态的周期性拉伸能诱导Caspase-3 和Caspase-9 的活性升高，诱导视网膜周细胞凋亡，从而加重早期糖尿病视网膜病变[24]。与正常视网膜相比，糖尿病视网膜神经节细胞层中活性Caspase-3和Caspase-9 的表达增强，其上调与糖尿病视网膜病变的神经元变性有关[25]。本研究中PQJ 能明显降低STZ 诱导的DR 大鼠视网膜组织中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的增加。因此，PQJ 能通过调控视网膜组织细胞的凋亡，在DR 的防治中产生作用。

综上所述，本研究结果显示，PQJ 能显著降低DR 大鼠炎症细胞因子TNF-α 和IL-6 的水平，抑制血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的表达，抑制细胞凋亡相关蛋白，从而进一步调控DR 大鼠视网膜血管新生、炎性反应和细胞凋亡，为PQJ 应用于临床治疗DR 提供了有效的实验依据。