IGF-1R通过调控JAK/STAT信号通路对脓毒症大鼠作用机制的研究

胡 伟，张 涛，盛尚春，刘 翔，丁贵梅，代 琼（宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾 644000）

脓毒症（sepsis）是因感染引起的全身性炎症反应综合征，创伤、感染等是其常见的并发症，全球每天约有14 000 人死于其并发症[1-2]。脓毒症救治困难、预后不良，高发病率、高死亡率，是危重症病房常见病[3]。目前临床上采用液体复苏、抗感染及器官支持等治疗，但患者的死亡率仍然很高，可见寻找一种新的治疗方法尤为重要。脓毒症的发病机制较为复杂，有研究发现细胞因子网络和脓毒症的发生发展有密切关系，其会激活机体中的炎性细胞和免疫活性细胞，促进细胞因子释放，在脓毒症发病时通过调控Janus 激酶/信号转导和转录激活因子（janus kinase/signal transducer and activvator of transcription，JAK/STAT）信号通路参与脓毒症的发生[4-5]。有研究发现，JAK/STAT 通路可调节多种细胞因子信号通路，且STAT1和STAT3 参与大部分炎症侵袭细胞内的信号转导过程，影响脓毒症的发生、发展[6]。有文献报道，抑制JAK/STAT信号通路可减轻脓毒症大鼠的重要脏器功能损伤[7]。1型胰岛素样生长因子受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R）是一种跨膜受体，可调节细胞的分化增殖、机体免疫等生物学活性[8]。胰岛素样生长因子-1/2（insulin-like growth factor -1/2，IGF-1/2）是IGF-1R的同源配体，当IGF-1R 被IGF-1/2或胰岛素激活时，自身会发生磷酸化，进而激活磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信号通路，调节细胞周期和凋亡[9]。但IGF-1R 对JAK/STAT信号通路的调控，及对脓毒症大鼠的作用机制尚不明确，因此本文通过探究IGF-1R的作用机制，为临床治疗脓毒症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 60 只雄性大鼠均购自军事医学科学院实验动物中心。大鼠体质量220～250g，健康级，大鼠均饲养在统一的动物房内，室温20～24℃，相对湿度40%～50%，普通饲料喂养，自由饮食饮水，适应1 周新环境。本次实验经我院动物伦理审批同意。

1.2 试剂与仪器 IGF-1R，货号：HZ5445（ProsPec公司）；兔抗大鼠IGF-1 单克隆抗体（北京沃凯生物科技有限公司）；兔抗大鼠JAK1（批号：K0303）和STAT3（批号：C1303）单克隆抗体（广州翔博生物科技有限公司）；TG20 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；ts-100b 恒温摇床（江苏新春兰科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 脓毒症大鼠模型制备及分组：将60 只大鼠按照数字随机法随机分为三组，分别为假手术组(sham组)、脓毒症大鼠模型组（sepsis 组）和脓毒症大鼠模型给予IGF-1R 干预组（IGF-1R 组），每组20只。本文以盲肠结扎穿孔术为参照制备脓毒症大鼠模型。10g/dl 水合氯醛麻醉大鼠并固定，沿腹部中线切1.5 cm的小口，结扎盲肠，注意避免结扎回肠及盲肠系膜血管。分3 次穿刺盲肠，用留置的橡皮片贯穿盲肠，完成后将盲肠回归原来位置，逐层缝合皮肤。Sham 组大鼠仅开腹但不结扎盲肠。为防止大鼠休克立即皮下注射林格氏液10 ml，将大鼠放回笼内，给予充足的水分。

1.3.2 给药：造模成功后，IGF-1R 组经侧脑室定位注射药物，麻醉大鼠后固定头部。剔除头颅正中毛发并消毒，从右耳窝线中线开始向鼻侧做中切线，切1.5 cm的小口。分离各组大鼠皮下筋膜和骨膜，充分暴露前囟，在前囟向后0.8 mm、中缝靠右1.5 mm 处钻一小孔，以颅骨上缘为起点，在钻孔处将针垂直向下插入4.5 mm，同时向右侧脑室注射10 μl IGF-1R，保证药物流速为1 μl/min，注射完成20 min 后再缓慢拔出注射器，缝合消毒。Sham 组和sepsis 组大鼠均于同等位置注射10 μl的生理盐水干预，一天一次，连续注射7 天。

1.3.3 标本采集：消毒大鼠皮肤后开腹，完全分离腹主动脉，取腹主动脉血5 ml 至离心管中，12 000 r/min离心10 min，分离血清，-20℃保存待测。消毒皮肤后开腹，取出肺组织，置于消毒的冻存管中，放置-80 ℃环境中保存，待用。

1.3.4 免疫荧光染色检测大鼠肺组织中IGF-1R 阳性细胞比例:给药干预后麻醉各组大鼠，消毒开胸取肺组织，将组织用4g/dl 多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋，切片机切成5 μm的薄片，自来水冲洗，用枸橼酸缓冲液修复组织2 min，待切片组织冷却后冲洗，用画圈笔画圈。过氧化氢将组织在黑暗的环境中封闭20 min，PBS 溶液洗涤3 次，室温封闭1 h。每张切片加入50 μl的IGF-1R 抗体，4 ℃孵育组织过夜，PBS 再次清洗5 次。避光环境中加入二抗，室温孵育6 h 后再次清洗3 次，避光环境下将DAPI 加入，避光孵育11 min，PBR 溶液清洗3次后，用甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.5 ELISA 检测血清中IL-6和TNF-α 含量:分别取出三组大鼠的肺组织，将组织放置到均浆器中，同时把3 倍体积的磷酸缓冲液加入到均浆器中，制成组织均浆。离心机离心组织均浆，3 000 r/min 离心10 min，收集上清液，检测血清中IL-6和TNF-α 含量。

1.3.6 HE 染色检测肺组织病理形态变化：取各组大鼠左肺上叶组织，经梯度酒精脱水、石蜡包埋，用石蜡切片将组织切成厚度为6 μm的薄片，将组织进行常规的HE 染色后，每张切片随机取4 个清晰的视野于显微镜下观察。

1.3.7 TUNEL 检测细胞凋亡：肺组织与蛋白酶K室温孵育，切片浸入TUNEL 反应液中，后PBS 冲洗3 次。过氧化氢冲洗淬灭酶活性，后联合抗生物蛋白过氧化氢酶和二氨基联苯胺覆盖，凋亡细胞为棕黄色，随机选择5 个视野下的细胞观察凋亡率。

1.3.8 免疫印迹检测组织中p-JAK1和p-STAT3 蛋白表达：分别取三组大鼠50 mg 肺组织，用WB 裂解液裂解，研磨组织30 min，离心机离心，12 000r/min 离心5 min，收集上清液检测蛋白浓度，在每孔中加入50 μg的蛋白样品，根据蛋白浓度计算样本体积。把浓缩的SDS-PAGE 缓冲液加入到上清液中，加热上清液，5 min 后在预制的胶孔中把蛋白样本加入，在封闭的环境中孵育。1h 后加入一抗，TBST 溶液将蛋白样品清洗3 次，曝光成像后分析。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 软件进行本实验的统计学分析，满足正太性分布及方差的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间数据采用单因素方差分析；两组间数据用成组设计资料的t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织中IGF-1R 阳性细胞比例 组织中IGF-1R 阳性细胞在sham 组（58.32%±5.21%）、sepsis 组（21.65%±8.73%）和IGF-1R 组（46.58%±6.72%）占比比较，差异有统计学意义（F=141.7，P＜0.000 1）。和sham 组相比，sepsis 组大鼠肺组织中IGF-1R 阳性细胞在总细胞中所占的比例减少（t=16.13，P＜0.000 1）；IGF-1R 组大鼠肺组织中IGF-1R 阳性细胞在总细胞中所占的比例较sepsis 组增加（t=10.12，P＜0.000 1），差异均有统计学意义。

2.2 各组大鼠血清中IL-6和TNF-α 含量比较 见表1。 血清中IL-6 在sham 组、sepsis 组和IGF-1R 组的含量比较，差异有统计学意义（F=18.23，P＜0.000 1）；血清中TNF-α 在sham 组、sepsis组和IGF-1R 组的含量比较差异有统计学意义（F=130.7，P＜0.000 1）。和sham 组相比，sepsis组血清中IL-6和TNF-α 含量增加；IGF-1R 组血清中IL-6和TNF-α 含量较sepsis 组减少，差异均有统计学义（P＜0.000 1）。

表1 各组大鼠血清IL-6,TNF-α 含量（±s,pg/ml）

表1 各组大鼠血清IL-6,TNF-α 含量（±s,pg/ml）

项 目sham 组①sepsis 组②IGF-1R 组③① vs ②③ vs ②t P tP IL-64.35±2.019.81±4.265.11±2.575.18＜0.000 14.23＜0.000 1 TNF-α2.31±1.1214.15±3.266.58±2.1521.98＜0.000 112.01＜0.000 1

2.3 各组大鼠肺组织病理变化比较 见图1。Sham组大鼠肺组织正常，没有明显的病理改变；sepsis组肺组织有大量的炎性细胞浸润，肺泡间隔明显厚于sham 组，部分肺组织完整性受到破坏。和sepsis组大鼠相比，IGF-1R 组大鼠肺组织得到了明显的改善。

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE 染色，×100）

2.4 各组大鼠肺组织细胞凋亡率比较 见图2。细胞凋亡率在sham 组（6.35%±2.51%）、sepsis 组（37.84%±6.62%）和IGF-1R 组（22.71%±4.28%）间比较差异有统计学意义（F=217.4，P＜0.000 1）。和sham 组相比，sepsis 组细胞凋亡率增加（t=19.89，P＜0.000 1）；和sepsisi 组相比，IGF-1R 组大鼠细胞凋亡率降低（t=8.583，P＜0.000 1），差异均有统计学意义。

图2 各组大鼠肺组织细胞凋亡情况（TUNEL 染色，×100）

2.5 各组大鼠肺组织中p-JAK1和p-STAT3 蛋白表达比较 肺组织中p-JAK1 在sham 组（0.15±0.11）、sepsis 组（0.33±0.16）和IGF-1R 组（0.17±0.13）中表达差异有统计学意义（F=10.70，P=0.000 1）。肺组织中p-STAT3 在sham 组（0.12±0.10）、sepsis组（0.28±0.15）和IGF-1R 组（0.19±0.12）中表达差异有统计学意义（F=8.230，P=0.000 7）。和sham 组相比，sepsis 组肺组织中p-JAK1和p-STAT3蛋白表达增加（t=4.146,3.969,P=0.000 2,0.000 3）；IGF-1R 组大鼠肺组织中p-JAK1和p-STAT3 蛋白低于sepsis 组（t=3.471,2.095,P=0.001 3,0.042 9）。

3 讨论

脓毒症的高发病率、高死亡率严重威胁患者的生命健康[10-11]。脓毒症的病理性表现以急性炎症为主，包括TNFα，IL-1β和IL-6 等炎症介质过度释放[12]。虽然目前抗生素的完善一定程度提高了脓毒症患者的病死率，但对复杂的脓毒症发病机制认识尚不全面，持续炎症、免疫抑制等新问题也逐渐出现，因此降低脓毒症患者的病死率和发病率是目前临床亟待解决的问题。IGF-1 主要由肝脏分泌，其会通过内分泌、自分泌、旁分泌等不同的分泌方式和靶细胞表面的1 型胰岛素样因子受体（IGF-1R）相结合，进而调节外周组织、细胞的生理和病理变化。有研究发现IGF-1R 能调节脓毒症患者机体内的炎症反应，但其具体的作用机制尚不明确，因此本研究对脓毒症大鼠给予IGF-1R 干预治疗，研究其对脓毒症的作用机制[13]。

脓毒症早期会释放大量的炎症因子且浸润到细胞中，减少中性粒细胞的凋亡，损伤毛细血管及血管功能障碍，进而导致肺间质严重水肿、蛋白出现渗漏等多种不同机制的发生，和脓毒症致急性肺损伤有密切关系[14]。有研究显示，机体内的炎症反应失调是导致脓毒症所致肺损伤的主要发病机制，其中IL-6 是最主要的一种内源性炎症细胞因子，可启动机体内的炎症反应，还能对炎症反应进行催化和放大，有效判断炎症程度，进而影响机体的炎性反应。有学者通过对脓毒症患者体内炎症因子检测时发现IL-6和TNF-α 含量增加，抑制IGF-1的合成，降低机体血液中IGF-1水平，增加脓毒症发生时的细菌移位，最终加重脓毒症患者病情[15]。本研究结果显示脓毒症大鼠血清中IL-6和TNF-α 含量升高，IGF-1 阳性表达降低，细胞出现大量的凋亡；IGF-1R 干预后脓毒症大鼠血清中的炎症因子减少，且细胞凋亡率也降低，提示IGF-1R 对脓毒症所致肺损伤有一定治疗作用。TIAN 等[16]研究证实，在脓毒症患儿中IGF-1表达降低，并在病程中保持稳定，但血糖变化和IGF-1 没有明显的联系。

有研究发现JAK/STAT信号通路是炎症反应中最显著的细胞内信号网络之一[17]。白介素、干扰素、肿瘤坏死因子招募JAK 蛋白结合于受体表位，使JAK 蛋白彼此靠近而相互磷酸化激活，激活的JAK进一步对STAT 蛋白磷酸化，致使其二聚化入核，识别特定的DNA 序列，调控靶基因的表达，介导B淋巴细胞转换和T 淋巴细胞增殖分化，并通过释放大量的炎症因子和趋化因子，使得巨噬细胞、中性粒细胞聚集，介导炎症反应[18-19]。JAK/STAT 通路参与炎症免疫反应的应答，对脓毒症所致急性肺损伤的机制中信号转导具有重要意义。

有研究证实，JAK/STAT信号通路可调节CLP诱导的脓毒症大鼠模型的急性肺损伤，同时抑制JAK 或STAT 可减轻严重脓毒症所致的急性肺损伤和致死性[20]。本研究结果显示，脓毒症大鼠组织中JAK/STAT信号被激活，促进了p-JAK1和p-STAT3表达；IGF-1R 干预后可抑制JAK/STAT信号，进而减轻脓毒症所致急性肺损伤，提示抑制JAK/STAT通路的激活可减轻脓毒症所致的急性肺损伤。XIE等[21]通过对大鼠实验研究证实，电针可抑制脓毒症最大数炎症介质的释放，抑制细胞凋亡，进而减轻脓毒症大鼠的肺损伤，其机制是通过调节JAK1/STAT3 通路来实现的。

综上所述，IGF-1R 可对JAK/STAT信号通路进行调节，降低血清中炎症因子的含量，进而改善脓毒症所致的急性肺损伤。但由于本研究选取的样本数量和动物有限，使本文存在一定的局限性。在今后的实验中，会加大样本的研究数量，且进行人体实验研究，以进一步验证IGF-1R 在脓毒症中的应用价值。