血清TLR-3，miR-181b及URBP联合检测在糖尿病肾病诊断及预后判断的价值研究

祁桠楠，胡江伟，武 亮，高 倩，周雨聪，郑慧霄

（邢台医学高等专科学校第二附属医院a.体检中心;b.内分泌科;c.肾内科,河北邢台 054000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见慢性并发症之一，发生率约占2 型糖尿病总人数的30%～35%[1]，亦是导致终末期肾病（endstage renal disease，ESRD）的首要原因[2-4]。因此，早期诊断DN 具有重要临床价值。尿视黄醇结合蛋白（urinary retinol binding-protein，URBP）是反映肾近曲小管及肾功能早期损伤的较为理想指标。miR-181b 属微RNA（microRNA，miR）的一种，前期研究已证实[5]，可靶向调控基质金属蛋白酶抑制因子3，在功能上参与DN的发病机理。另有研究发现，DN 发生可能与Toll 样受体（Toll like receptor，TLR）异常表达存在一定关联性[6]，但关于TLR-3，miR-181b，URBP表达与DN 病情程度的关系及联合诊断价值仍有待进一步验证。基于此，本研究检测TLR-3，miR-181b，URBP表达，分析其对DN 患者的诊断价值及与预后的关联性，旨在为临床诊治、预后评估提供科学指导。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年12月～2018年12月邢台医学高等专科学校第二附属医院收治的115 例DN 患者作为观察组，另选取同期96 例2 型糖尿病作为对照组。其中观察组：男性68 例，女性47例，年龄42～69 岁，平均50.97±3.62 岁；体质量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.5～12.2年，平均9.26±1.28年。对照组：男性56例，女性40 例，年龄53～75 岁，平均63.11±4.92 岁；体质量52～76kg/m2，平均62.85±4.56kg/m2；糖尿病病程5.0～12.4年，平均8.99±1.35年。两组基本资料（性别、年龄、体质量、糖尿病病程）均衡可比（P＞0.05）。本研究经我院医学伦理委员会审批同意。

纳入标准：1.观察组均符合DN 诊断标准[7]，并符合以下标准：①6 个月内连续尿液检查有2 次尿清蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER）为20～200 μg/min，或30～300 mg/24 h；②尿沉渣异常；③肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）≤60 ml/（min·1.73m2）。2.对照组均符合2 型糖尿病相关标准[8]，且空腹血糖（fasting plasma glucos，FPG）≥7.0mmol/L 或口服葡萄糖耐量试验（oral glucose tolerance test，OGTT）2 h 血糖≥11.1mmol/L。3.患者及家属均签署知情同意书。排除标准：①并发糖尿病酮症酸中毒、糖尿病足溃疡等严重并发症者；②原发性肾病者；③并发风湿性疾病、高血压疾病或心血管疾病者；④既往有肾脏外伤或手术史者；⑤近期有免疫抑制剂或其他肾脏毒性药物服用史者；⑥精神行为异常者。

1.2 仪器与试剂 ABI7900 实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）；BNP 特定蛋白分析仪（德国SIEMENS 公司）；速率免疫散射比浊法试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 URBP水平检测：采集新鲜晨尿5 ml，采用BNP 特定蛋白分析仪以速率免疫散射比浊法检测URBP水平。

1.3.2 血清TLR-3，miR-181b水平检测：清晨空腹抽取肱静脉血10 ml，4 500 r/min，离心10 min，分离取血清，检测TLR-3，miR-181b 浓度，根据GenBank 数据库，获取2 个基因多态性位点序列，设计待测基因位点的聚合酶链反应（PCR）扩增引物及单碱基延伸引物，其中TLR-3 上游引物为5’-AGCCTTCAACGACTGATGCT-3’，下游引物为5’-TTTCCAGAGCCCTGCTAAGT-3’；miR-181b 上游引物为5’-GCGGATCATTCATTGCTGTCG-3’，下游引物为5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3。根据20 μl 模板、50 μl 反应液构成PCR 反应体系，扩增条件：95℃ 5 min，93℃ 10 s，61℃ 30 s，反复循环40 次，61℃时采集荧光，以实时荧光定量PCR仪检测TLR-3，miR-181b，并以2-△△Ct计算TLR-3，miR-181b 相对表达量。

1.3.3 肾脏病理损伤程度：采用肾小管萎缩与间质纤维化（IFTA）、间质炎症、肾小球分级评分进行评估，其中IFTA 评分0分为无IFTA；1分为轻度，即病变程度＜25.0%；2分为中度，即病变程度25.0%～50.0%；3分为重度，即病变程度＞50.0%；间质炎症评分0分为无，1分为与IFTA 相关的炎性浸润，2分为无IFTA 区域也存在炎性浸润；肾小球分级I 级为单纯肾小球基底膜增厚，Ⅱ级为系膜基质增宽，Ⅲ级为结节性硬化，Ⅳ级为晚期糖尿病肾小球硬化。

1.4 统计学分析 采用SPSS19.0 统计学软件分析数据，正态分布资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验；相关性采用Spearman 相关分析法；URBP及血清TLR-3，miR-181b 诊断价值评价采用敏感度、特异度表示，并以Med Calc 绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析单独检测和联合检测的诊断价值，以Hanley-McNeil 方法比较ROC 曲线下面积（area under curve，AUC）。以α=0.05 为校验水准。

2 结果

2.1 两组TLR-3，miR-181b，URBP 检测水平比较 观察组URBP（4.12±1.24mg/L vs 2.88±0.86mg/L）及血清TLR-3（0.86±0.27 vs 0.59±0.18），miR-181b（2.55±0.76 vs 1.79±0.54）水平均高于对照组，差异有统计学意义（t=8.275,8.367,8.217,均P＜0.001）。

2.2 观察组不同肾脏病理损伤程度TLR-3，miR-181b，URBP 检测水平 见表1。观察组不同肾脏病理损伤程度患者URBP及血清TLR-3，miR-181b水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表1 观察组不同肾脏病理损伤程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比较(±s)

表1 观察组不同肾脏病理损伤程度TLR-3，miR-181b，URBP水平比较(±s)

肾脏病理损伤程度nTLR-3FPmiR-181bFPURBP（mg/L）FP间质炎症（分）2321.10±0.33 24.213 ＜0.001 3.36±1.01 29.028 ＜0.001 5.45±1.64 31.789 ＜0.001 1500.85±0.262.47±0.744.05±1.22 0330.64±0.201.89±0.572.94±0.88 IFTA 评分（分）3291.09±0.32 15.375 ＜0.001 3.53±1.06 24.236 ＜0.001 5.69±1.71 23.905 ＜0.001 2400.88±0.262.52±0.754.06±1.22 1300.76±0.232.07±0.623.42±1.03 0160.58±0.171.75±0.532.74±0.82肾小球分级 Ⅳ241.05±0.31 13.906 ＜0.001 3.52±1.06 21.372 ＜0.001 5.98±1.80 27.603 ＜0.001Ⅲ450.93±0.282.64±0.804.18±1.25Ⅱ210.80±0.242.11±0.633.39±1.02Ⅰ250.60±0.181.83±0.552.84±0.85

2.3 肾脏病理损伤程度与TLR-3，miR-181b，URBP 相关性 见表2。Spearman 相关性分析结果显示，DN 患者间质炎症、IFTA 评分、肾小球分级与URBP及血清TLR-3，miR-181b水平呈正相关关系（均P＜0.05）。

表2 肾脏病理损伤程度与TLR-3，miR-181b，URBP 相关性

2.4 TLR-3，miR-181b，URBP 单独及联合诊断DN的ROC 曲线分析 见图1。经URBP及血清TLR-3，miR-181b及三者联合诊断DN的AUC分别为0.751，0.782，0.796和0.880，三者联合诊断AUC 大于单独诊断（P＜0.05）。

图1 URBP及血清TLR-3，miR-181b单一及联合诊断DN的ROC 曲线

2.5 TLR-3，miR-181b，URBP与远期预后关系 见表3。随访12 个月，13 例DN 患者失访，其中4 例电话号码错误，4 例电话停机，5 例更换住址，剩余102 例共有35 例发展为ESRD，占比34.31%。根据ROC分析TLR-3，miR-181b，URBP 临界值分组，当其＞0.64mg/L，＞2.40mg/L，＞3.7 mg/L为高表达，反之为低表达。URBP，miR-181b 高表达者ESRD发生率高于低表达者，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

表3 URBP及血清TLR-3，miR-181b与远期预后关系[n（%）]

3 讨论

肾脏活检是既往临床诊断DN的金标准，但其属有创操作，临床应用受到一定限制[9]。因此，探寻一种理想的DN 诊断标志物具有重要临床价值。

miR-181b 参与机体生理、病理过程的调控过程[10-11]。本研究中，血清miR-181b 在DN 患者中过度表达，与王琳琳等[12]研究结果基本一致，并随间质炎症加重、肾小球分级及IFTA 评分增加而升高，这可能归因于长期高糖状态下，miR-181b表达显著升高，可诱导体内蛋白质与血糖非酶结合，形成糖基化终末产物，产生过量自由基，进而加重肾小球血管内皮细胞损伤，破坏肾小球滤过屏障，导致持续性蛋白尿，从而造成细胞外基质大量堆积，加剧肾脏损伤程度，最终形成恶性循环。以上分析与结果说明miR-181b 参与DN的发生发展，可作为潜在分子生物学标志物。另外，本研究还发现，miR-181b 高表达可能增加DN 患者ESRD 发生风险，与王家芷等[13]观点相似，说明高水平miR-181b 会影响DN 患者预后改善，早期检测miR-181b水平有助于指导临床评估预后。

TLR 信号是机体抵抗微生物感染的第一道防线，过度活化会导致炎性细胞浸润，细胞及化学因子大量释放，自身抗体产生[14]。本研究数据表明，TLR-3 高表达可能参与DN 病理进展。分析机制可能为TLR-3水平升高，可活化核转录因子信号通路，刺激CD80分子高表达，提高肾脏炎性反应，加重巨噬细胞浸润，促进足突细胞融合，释放大量蛋白尿水平，从而进一步提高DN 发生危险性。本研究还发现，血清TLR-3水平与DN 患者肾脏病理损伤程度有关。DN 发生可激活TLR3 信号通路，诱导肾小管上皮细胞释放致炎因子，激活肾间质固有细胞，导致肾间质炎性细胞浸润，细胞外基质大量堆积，介导肾脏病理损伤。提示以TLR-3 为靶点，抑制TLR-3表达，可能为预防DN 患者肾脏病理损伤提供新的策略。但TLR-3 高表达对DN 患者发生ESRD的影响小，可能与临床尚未完全明确TLR-3在介导肾脏纤维化中的具体机制有关。

视黄醇结合蛋白（RBP）是血液中转运视黄醇类物质的载体蛋白，在尿液中较为稳定[15]。曾福英等[16]报道指出，随着DN分期进展，RBP水平呈升高趋势，可作为DN 早期诊断的标志，支持本研究观点。DN 发生时，肾小管上皮细胞分化，可引起细胞功能紊乱，加重肾小管炎症损伤，破坏肾小球滤过功能，主要表现为URBP水平异常升高[17]。经Spearman 相关性分析还显示，URBP与DN 患者间质炎症、IFTA 评分、肾小球分级均存在正相关关系。充分说明URBP 有望成为评估DN 患者肾损伤的重要指标。机制在于，URBP水平升高会进一步破坏肾近曲小管重吸收功能，加重水盐代谢紊乱，主要表现为尿液增多或水钠潴留，从而加重肾脏病理损伤程度。另外，URBP 高表达会增加DN 患者ESRD 发生率，可能与肾小管细胞功能紊乱加重、脂联素合成量减少有关。然而URBP 诊断DN的敏感度仅为56.52%，故本研究选择联合诊断，结果显示，URBP及血清TLR-3，miR-181b 联合诊断DN的AUC 为0.880，敏感度为72.17%，特异度为88.54%，提示三者联合可能成为DN 诊断的潜在理想内源性标志物，为临床提供治疗新靶点。

综上可知，URBP及血清TLR-3，miR-181b与DN 患者肾脏病理损伤程度有关，三者联合可作为判定DN的生物学标志物，指导临床防治ESRD。但本研究未研究URBP及血清TLR-3，miR-181b之间相互调控关系及可能作用机制，今后需扩大样本量进一步研究，以期为DN 联合靶向治疗提供科学支持。