SNP rs951781影响食管癌患者的术后生存

孙 琳，宋 昕，魏梦霞，赵学科，徐瑞华，李 贝，范宗民，韩雪娜，陈亚杰，钟 侃，乔佳欣，马琳琳，谢叶真，王立东

食管癌(esophageal cancer,EC)是世界上排名第六的恶性肿瘤。在中国，食管癌发病率居第六位，死亡率居第四位，预后差，中晚期EC的5 a生存率仅为15%～25%[1-3]。但EC至今缺乏较高敏感性和特异性的早期筛查和诊断方法。本研究团队在60 a的食管癌研究过程中已建立50万例跨度47 a(1973 年至 2019年)的食管癌和贲门癌患者随访的临床诊疗、病理信息大数据库和大样本库。全基因组外显子测序(whole exome sequence，WES)技术用于分析个体的全基因组DNA外显子序列，已经被广泛应用于肿瘤治疗领域。相比于全基因组测序，WES周期短、成本低、深度高，可以检测到比全基因组测序更多的低频和罕见突变，从而可以分析大量的样本[4-6]。表达数量性状基因座(expression quantitative trait loci,eQTL)分析方法是将不同基因型个体的基因表达数据作为数量性状，分析基因型对基因转录的影响。eQTL作用可根据遗传变异位点与靶基因的相对位置分为顺式(cis)和反式(trans)[7]。本研究旨在采用WES测序和eQTL的方法对食管癌患者癌组织和癌旁组织不同单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)基因型进行对比分析，为临床食管癌发病风险预测和早期诊断提供分子基础，揭示分子基础及环境和遗传因素交互作用对食管癌发生的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样本来源

1.1.1 研究对象的采集共收集来自高发地区医院的199位食管癌患者的癌组织和癌旁组织。所用组织样品均为新鲜组织样本，在手术切除后30 min内剥离，-80 ℃保存。癌旁正常组织选取距肿瘤边缘至少2 cm远的邻近上皮正常组织(生殖系对照)。患者在入组前未接受放化疗等其他治疗，排除围手术期内吻合口瘘死亡的患者。所有患者都签署了独立的知情同意书，用于取样和分子分析，并已获得了相关机构的审查和批准。本研究主要通过电话、家访和村医与患者或患者家属直接联系，或通过新合作医疗数据库、医疗保障局数据库和公民死亡信息登记管理等系统查询方式进行随访，每3个月进行1次随访，记录去世时间和主要死因等。

1.1.2 组织样本的制备将199例食管癌患者的癌组织和癌旁组织配对，分装到已经标记的冻存管内，样本编号为001～199号。在样本类型中，食管癌组织用字母T标记(Tumor)，癌旁正常组织用字母N标记(Normal)。收集到的样品在液氮中快速冷冻并保存，同时保证每份样品有足够的DNA可供提取。

1.2 WES测序SNP分析

1.2.1 DNA样品检测利用琼脂糖凝胶电泳分析DNA样本是否有蛋白、RNA污染及其降解程度。用Nanodrop2000(Thermo，美国)检测DNA的纯度，并用Qubit 3.0测出DNA样品浓度，选择0.6 μg以上的DNA样品进行后续建库。

1.2.2 建库捕获及上机测序采用Agilent液相芯片捕获系统，对患者全外显子区的DNA进行富集，基因组DNA经破碎仪随机打断成片段，采用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行建库及捕获。后在Illumina平台上进行高通量测序。

1.2.3 数据质量控制高通量测序获得的原始图像数据经过转化后形成原始Raw Data测序序列。将原始Raw Data数据进行过滤，并且控制平均碱基位置测序错误率低于0.1%，样本的测序reads达到95%以上的比对率，且碱基覆盖深度达到10×以上时该点检测的SNP比较可信。

1.2.4 SNP检测和功能注释使用bcftools软件识别SNP，并利用ANNOVAR软件对多态性位点进行功能注释。

1.3 蛋白质组学分析与鉴定

采用液相色谱—质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术对199例食管癌的癌组织和癌旁组织样本进行分析。

1.4 eQTL分析

利用199例食管癌患者的基因型分型数据以及癌组织和癌旁组织的全基因组外显子测序数据进行eQTL分析，根据SNP位点(即单个DNA突变的位点)到基因的距离，eQTL可分为顺式作用(cis-eQTL)和反式作用(trans-eQTL)。

1.5 统计学分析

统计学处理采用SPSS 21.0进行分析。高发区癌组织与癌旁组织的SNP影响蛋白的表达，从而导致肿瘤的发生采用双重线性回归检验，生存率采用Kaplan-Meier方法。检验标准α=0.05。

2 结果

2.1 全基因组外显子测序结果

通过对199例食管癌患者癌组织和癌旁组织的WES分析，NES基因rs951781位点的SNP分型：①野生型纯合子CC型158例，占79.40%；②突变型杂合子CT型37例，占18.60%；③突变型纯合子TT型4例，占2.01%。

2.2 NES基因rs951781位点不同基因型食管癌患者生存率比较

对199例食管癌患者3种基因型的生存期进行比较，不同基因型食管癌患者的生存之间存在显著性差异(P=0.018)。CC型的生存率最差，TT型的生存率最高，生存曲线如图2所示，对野生型纯合子CC型、突变型杂合子CT型、突变型纯合子TT型的0.5、1、1.5 a生存率进行比较。

图2 NES 3种基因型生存曲线(n=199)

2.3 eQTL分析结果

通过对199例食管癌患者癌组织和癌旁组织进行eQTL分析，发现 ACTB的表达量与NES基因rs951871位点变异存在关联性(P<0.001)。NES基因rs951871位点对ACTB的转录表达水平有trans-eQTL效应，可下调ACTB蛋白的表达水平(beta=-0.43)，将野生型纯合子CC型赋值为0，突变型杂合子CT型赋值为1，突变型纯合子TT型赋值为2。其中，NES基因rs951871位点的突变型纯合子TT型蛋白表达量最低，突变型杂合子CT型次之。见图3。

图3 NES 3种基因型对ACTB表达量的影响

3 讨论

食管癌的发生与环境和遗传因素密切相关。吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒感染等环境因素暴露个体并非均患有食管癌，遗传因素在食管癌发生过程中可能发挥重要作用[8]。目前已发现超过100个基因含有罕见的易感等位基因，且与食管癌发生风险有关[9-14]。

NES-rs951871位点SNP与食管癌的相关研究相对较少。本研究结果显示，NES-rs951871位点的基因型与食管癌患者预后生存期有关，不同基因型食管癌患者的生存之间存在显著差异(P=0.018)。突变型纯合子TT型的生存率最好，TT基因型患者0.5、1、1.5 a生存率均高于CC基因型和CT基因型，说明NES-rs951871位点TT基因型患者预后优于CC、CT基因型患者，推测NES-rs951871位点突变的食管癌患者预后较好，提示 NES-rs951871位点与食管癌的发生发展有密切的关系，可能是预测食管癌患者生存期的生物标志物，为评估患者预后提供理论依据。

NES基因rs951871位点的多态性可显著影响食管癌患者癌组织和癌旁组织中的β-肌动蛋白(ACTB)蛋白水平，NES基因rs951871位点风险等位基因T的剂量每增加1，受调控的ACTB蛋白表达量下调0.43个单位。ACTB是一种高度保守的细胞骨架结构蛋白，多年来一直被认为是一种常见的看家基因，并被用作参考基因[15]。近年来越来越多的研究表明ACTB在肺癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤，结直肠癌等多种癌症中表达水平较高[16-19]，也有免疫相关结果表明ACTB在调节肿瘤免疫微环境中发挥特定作用，异常的ACTB表达可能会改变肿瘤免疫微环境，从而影响肿瘤的侵袭和转移[20]。故推测NES-rs951871位点为功能性SNP，其多态性可能影响了与该段DNA序列相互作用的反式作用因子的结合能力，从而影响ACTB蛋白的表达，进而最终影响了食管癌的发生发展。但NES-rs951871的具体作用机制还有待进一步研究。