LncRNA ZEB2-AS1靶向Wnt/β-catenin信号通路对食管癌增殖和侵袭的影响及机制研究

张秀森，王海瑞，刘书培，赵 迪，高社干,2

食管癌是消化道常见恶性肿瘤，河南属于高发区[1]。食管癌的早期诊断缺乏特异性，多数患者发现异常检查确诊时已处于中晚期[2]。尽管目前食管癌的治疗手段颇多，但由于其恶性程度高、发现诊断晚，多数患者预后仍不佳[3]。因此，探讨食管癌发生发展的分子机制对发现新的治疗靶点和改善预后有重大意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸、蛋白编码能力极低的内源性RNA，已被证明基本参与了各种基础生物学事件和疾病[4-5]。LncRNA ZEB2-AS1是一种新型的lncRNA，研究表明其异常表达与肺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌等的进展及预后有关。LncRNA ZEB2-AS1在食管癌中的表达情况及作用机制尚不清楚。本研究通过干扰LncRNA ZEB2-AS1在食管癌中的表达，探寻其对食管癌细胞增殖及侵袭影响的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料人正常食管上皮细胞系HEEC及食管鳞癌细胞系(KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706)均来源于河南科技大学第一附属医院河南省肿瘤表观遗传重点实验室。细胞培养基为RPMI-1640(博士德生物工程有限公司)、蛋白印迹试剂盒(康为世纪生物科技股份有限公司)、荧光定量PCR试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)、INVI DNA RNA Transfection Reagent转染试剂(美国invigentech公司)、Transwell小室(美国Corning公司)、si-LncRNA ZEB2-AS1及si-NC序列由广州易锦公司设计合成。

1.2 细胞培养完全培养基(RPMI-1640+10%FBS，1%青链霉素)培养KYSE150细胞，37 ℃，5%CO2的恒温培养箱中，2～3 d换液1次，细胞长至80%左右传代，取对数生长期细胞做下一步实验。

1.3 实时定量PCR提取人食管上皮细胞系HEEC及食管鳞癌细胞系(KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706)的总RNA，逆转录为cDNA后采用RT-PCR测定LncRNA ZEB2-AS1 的mRNA相对表达量，反应条件为：95 ℃ 12 min；95 ℃ 30 s、60 ℃ 60 s，40个循环；72 ℃ 10 min。LncRNA ZEB2-AS1 PCR引物序列，正向，5’-ATG AAG AAG CCG CGA AGT GT-3’，反向,5’-CAC ACC CTA ATA CAC ATG CCC T-3’; GAPDH 正向,5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，反向,5’-TCC ACC CTG TTG CTG TA-3’。按2-ΔΔCt法计算上述细胞系中LncRNA ZEB2-AS1的表达水平。

1.4 细胞转染转染前1 d，将细胞接种于无抗生素的10%胎牛血清的1640培养基中，按照密度为1×105个细胞/孔接种于6孔板中。取对数生长期细胞，使用INVI DNA RNA Transfection Reagent转染试剂转染，10 h后更换培养基。转染24 h后，收集细胞进行下一步分析。

1.5 细胞增殖实验采用CCK8法测定细胞系KYSE150的增殖能力，将对数生长的细胞以每孔3.0×103个细胞的密度接种在96孔板中。细胞分别孵育0、24、48、72和96 h。加入CCK8液10 μL，在450 nm波长下测定OD值，并制作细胞增殖曲线。

1.6 Transwell实验根据不同的分组，在Transwell小室上腔室中加入1×105个细胞置于无血清或生长因子的培养基中，在下腔室中使用补充有10%胎牛血清的培养基作为化学引诱剂。孵育24 h后，取出小室，用棉签除去未侵入膜的细胞，用4%的甲醛固定小室上的穿膜细胞，用结晶紫染色，镜下计数细胞量。

1.7 Western-blotting收集相应处理的细胞，加入裂解液，冰上匀浆。4 ℃离心，收集上清，提取蛋白。采用BCA定量法测定蛋白含量。行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，80V转膜2.5 h后封闭1 h。4 ℃一抗孵育过夜。使用含Tween-20的Tris缓冲液(tris buffered saline tween，TBST)清洗3×5 min，加入二抗室温孵育2 h。TBST 3×5 min清洗，暗室下加入ECL发光液曝光，拍摄图片并记录相应蛋白条带灰度值。

2 结果

2.1 LncRNA ZEB2-AS1在食管癌细胞系中的表达qRT-PCR结果显示，食管癌细胞系KYSE140、KYSE150、KYSE450、KYSE30、KYSE70、EC9706中LncRNA ZEB2-AS1相对表达量均高于HEEC细胞系(P<0.05)，以KYSE150细胞系中相对表达量最高，因此后续选用KYSE150细胞进行实验，见图1。

①与HEEC组比较，P<0.05。

2.2 LncRNA ZEB2-AS1沉默细胞系构建实验分为si-LncRNA ZEB2-AS1组、si-NC组、NC组，用慢病毒包装试剂盒将LncRNA ZEB2-AS1及si-NC转染到细胞系中，用嘌呤霉素筛选稳定细胞系，共聚焦显微镜观察荧光效果，图2A。qRT-PCR示，KYSE150细胞转染si-LncRNA ZEB2-AS1后，si-LncRNA ZEB2-AS1组LncRNA ZEB2-AS1相对表达量为3.12±0.12，si-NC组LncRNA ZEB2-AS1相对表达量为10.49±0.32，NC组LncRNA ZEB2-AS1相对表达量为11.61±0.27，si-LncRNA组中LncRNA ZEB2-AS1相对表达量低于si-NC组和NC组(均P<0.01)，提示LncRNA ZEB2-AS1表达沉默成功，见图2B。

A：LncRNA ZEB2-AS1沉默细胞；B：LncRNA ZEB2-AS1沉默效率测定。①P<0.01。

2.3 沉默LncRNA ZEB2-AS1表达可抑制食管癌细胞增殖CCK8示，转染24 h，si-LncRNA ZEB2-AS1组、si-NC组及NC组A450nm值比较，差异无统计学意义(P>0.05)；转染48 h，si-LncRNA ZEB2-AS1组A450nm值低于si-NC组[(0.27±0.13)VS (0.52±0.1)，P<0.05]；转染72 h，si-LncRNA ZEB2-AS1组A450nm值低于si-NC组[(0.53±0.13)VS (1.36±0.14)，P<0.05]；转染96h，si-LncRNA ZEB2-AS1组A450nm值低于si-NC组[(0.62±0.13)VS(1.78±0.13)，P<0.05]，上述研究结果提示沉默si-LncRNA ZEB2-AS1表达后，细胞增殖能力受到抑制。见图3。

①与si-LncRNA ZEB2-AS1组比较，P<0.05。

2.4 沉默LncRNA ZEB2-AS1表达抑制食管癌细胞侵袭Transwell侵袭实验显示：si-LncRNA组侵袭细胞数少于si-NC组[(63.0±1.58)VS (126.0±3.22)，P<0.05]，si-LncRNA组侵袭细胞数少于NC组[(63.0±1.58)VS (110±3.6)，P<0.05]，而si-NC组和NC组间侵袭细胞数差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

2.5 沉默LncRNA ZEB2-AS1表达对食管癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响Western blot检测结果显示，沉默LncRNA ZEB2-AS1表达后，si-LncRNA ZEB2-AS1 组 Wnt1 蛋白相对表达量低于si-NC 组[(0.35±0.03)VS (1.25±0.03)，P<0.05]，而si-NC组与NC组差异无统计学意义(P>0.05)，si-LncRNA ZEB2-AS1组β-catenin蛋白相对表达量低于si-NC组[(0.42±0.01)VS (0.90±0.06)，P<0.05]，而si-NC组与NC组差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

A：3组Wnt及β-catenin蛋白相对表达量比较；B：Western blot示3组Wnt及β-catenin蛋白表达。1：si-LncRNA ZEB2-AS1组；

3 讨论

食管癌是发生于上消化道的常见恶性肿瘤之一，其死亡率居高不下，分布有明显的地域性和种族性，在中国河南林州市高发。食管癌最典型的症状是进行性咽下困难，但早期症状不特异，发现时通常为晚期，预后极差。目前手术、放化疗是食管癌的主要治疗方法，但效果欠佳。因此，食管癌发生、发展及转移相关分子靶点的寻找至关重要，以预测肿瘤的发生、发展、转移及预后情况，针对新靶点的治疗同样具有极其重要的意义。锌指E盒结合同源盒2反义RNA1(LncRNA ZEB2-AS1)是来自ZEB2启动子的非编码反义转录物，文献报道在多种癌症中发挥关键作用，促进癌症的发生发展[6-8]。在非小细胞肺癌中lncRNA ZEB2-AS1通过下调PTEN来提高非小细胞肺癌细胞的生存力和恶性程度，从而促进非小细胞肺癌的进展[9]。在结肠癌中，lncRNA ZEB2-AS1可通过miR-143/bcl-2轴促进结肠癌细胞增殖并抑制凋亡，从而促进结肠癌的发展[10]。在胃癌中，LncRNA ZEB2-AS1表达量升高，可通过激活Wnt/β-catenin通路[11]，有助于胃癌的肿瘤形成，同时可通过miR-143-5p/HIF-1+轴影响细胞增殖和入侵[12]。LncRNA ZEB2-AS1还可通过调节miR-204/HMGB1轴促进胰腺癌细胞的生长和入侵[13]。

本研究结果显示，LncRNA ZEB2-AS1在食管癌细胞系中表达上调，且在不同分化程度的细胞中表达量不同，分化程度越低，LncRNA ZEB2-AS1的表达量越高，在一定程度上可认为与患者的不良预后有关。CCK8法检测下调LncRNA ZEB2-AS1表达对食管癌KYSE150细胞系增殖的影响，结果显示，下调LncRNA ZEB2-AS1表达可显著抑制KYSE150细胞增殖。Transwell侵袭实验显示下调LncRNA ZEB2-AS1表达后KYSE150细胞穿膜侵袭能力低于阴性对照组，提示下调LncRNA ZEB2-AS1表达可抑制食管癌细胞转移。最近研究显示在肝细胞癌中LncRNA ZEB2-AS1高表达，下调LncRNA ZEB2-AS1表达可显著抑制肝癌细胞增殖和侵袭过程[14]，与上述结果一致。在膀胱细胞癌、肺癌、胰腺癌和乳腺癌的研究中也发现相似结果[15-18]，下调LncRNA ZEB2-AS1的表达可抑制体外培养的癌细胞的增殖和侵袭能力。LncRNA ZEB2-AS1可以正向调节ZEB2的表达，ZEB2负责Wnt/β-catenin信号通路的激活[19-20]。Wnt/β-catenin信号通路是癌细胞发生进展的重要信号通路，在正常细胞中其处于低水平表达状态，当细胞发生癌变时，肿瘤细胞中Wnt/β-catenin信号通路的过度活化可促进其恶性进展，增强肿瘤细胞易转移性，增加治疗难度，同时恶化患者的预后[21-23]。本研究重点探讨LncRNA ZEB2-AS1表达水平及其对食管癌细胞系中Wnt/β-catenin信号通路的影响，结果发现，敲低或沉默LncRNA ZEB2-AS1可显著抑制Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Wnt1和β-catenin的表达，阻碍Wnt/β-catenin信号通路激活，从而抑制食管癌细胞的增殖和侵袭。

综上，食管癌细胞系中LncRNA ZEB2-AS1表达较高，通过下调LncRNA ZEB2-AS1表达可抑制食管癌细胞的增殖和侵袭能力，其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的抑制有关。因此，使LncRNA ZEB2-AS1表达下调可能是食管癌的一个新的潜在治疗策略。