毛蕊花糖苷对睾丸间质细胞氧化损伤的保护作用

陈 雪，安 英，沈 楠，徐 博，赵丽晶

（吉林医药学院基础医学院·吉林吉林·132013）

肉苁蓉为列当科植物苁蓉或管花肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉质茎，为我国传统名贵中药材，药用价值极高，在历代增力配方中使用频率居首位，在滋补、抗衰老延年类配方中居第位，仅次于人参。肉苁蓉作为两千年来使用频率最高的补肾壮阳中药，被美誉为“沙漠人参”，具有补肾壮阳，益精血、润肠通便、延缓衰老等疗效。研究发现，肉苁蓉可促进幼龄小鼠及大鼠睾丸生长发育，增加精囊前列腺的质量，证明其具有促激素样作用。对幼年去势大鼠，无论是生品还是炮制品，均可明显增加副性器官的质量，同样显示了雄激素样作用。近年来，国内外对肉苁蓉的化学成分进行了许多分析研究，已分离出多种类型的物质，如苯乙醇苷类、环烯醚帖类、挥发性成分、木质素类、多糖、生物碱等［1-3］。

毛蕊花糖苷(Acteoside，ACT)为苯乙醇苷类(phenylethanoid glycoside，PhG)化合物，是植物界中该类的代表性化合物，药理学研究证明，ACT具有广泛的药理作用，包括抗氧化、保护神经、改善学习记忆、抗炎、抗肿瘤、保护肝脏以及免疫调节等作用［4-8］。国内外有关毛蕊花糖苷在改善生精功能障碍、促进精子成熟领域的研究报道较少，尚缺乏系统深入的研究，本研究主要通过体外实验揭示毛蕊花糖苷对氧化损伤睾丸间质细胞保护作用。

1 材料和方法

1.1 TM3细胞株

TM3细胞株，购自中国科学院细胞库。

1.2 试剂

毛蕊花糖苷由维克奇生物科技有限公司提供；胎牛血清(Fetalbovineserum)、DMEM-F12、胰蛋白酶(tyrsin)，Gibeo公司；青霉素钠(penicillin)、硫酸链霉素(streptomycin)，西安制药公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、DMSO，美国Sigma公司；Trypsin、EDTA，Amresco公司。

1.3 仪器设备

CO2恒温细胞培养箱(SHELL/JB型)，美国Sartorius公司；全自动高压消毒锅（SM-51），日本Yamato公司；倒置相差显微镜，日本OlymPuS公司；超净工作室(FLB-lB型)，苏州苏静集团；-80℃低温冰箱，美国Revco公司；高速低温离心机(型号JZ-CM)，美国BECKMAN公司；Milli-Q、Synthesis超纯水系统，美国Millipore。

1.4 实验方法

1.4.1 睾丸间质细胞的培养与传代

从-80℃取出冻存的TM3细胞株，在37℃水浴融化后，迅速移至超净工作台上复苏，将其用移液枪加入含10%血清的F12培养液中，以1∶2的比例传代，在37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。次日观察细胞状态，用于后续试验。

1.4.2 细胞计数

1.4.2.1 细胞的传代

经步骤1.4.1培养的TM3细胞贴壁后，进行传代。在超净台中，打开酒精灯，在酒精灯周围打开瓶盖，瓶盖过火灭菌，倒掉原有培养基，PBS清洗3次，用移液枪吸取消化液加入瓶中，平铺瓶内，使消化液完全覆盖住瓶壁上的TM3细胞。一边晃动培养瓶一边观察，当瓶内细胞大块滑落，立即用移液枪取2mL含10%血清的F12培养液加入瓶内，终止消化。移液枪从瓶内一侧吹打细胞，形成单个细胞悬液。将细胞悬液移至无菌的离心管中，封口膜封好瓶口。将离心管对称放入离心机中1000rpm速度离心4min。离心后，弃上清，移液器吸出新的培养基加入管中与沉淀混合，再将悬液平均分到2个培养瓶中。

1.4.2.2 TM3细胞的分组

将细胞分为正常组、过氧化氢模型组、毛蕊花糖苷低剂量组（25μg/ml）、中剂量组（50μg/ml）、髙剂量组（100μg/ml）共5瓶细胞，在模型组、毛蕊花糖苷低、中、高剂量组加入400μmol/L过氧化氢作用4h后，分别加入相应浓度为25、50、100μg/ml的药物作用24h，备用。

1.4.2.3 MTT法检测细胞活性

TM3细胞长至约80%左右，消化细胞，进行细胞计数，调整细胞数量。在无菌的96孔板中接种细胞（106个细胞/孔），培养过夜。按1.4.2.2步骤进行细胞的分组，每组设5个复孔，加入5mg/ml四甲基偶氮唑蓝(MTT)溶液20μl/孔培养4h，吸弃培养液，每孔加人200μl DMSO室温振荡10min，在酶标仪上以490nm波长测定各孔吸光度(A值)，记录结果，实验重复3次，结果取均值。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

显微镜下可见：细胞培养24h后，贴壁的TM3细胞大部分都伸展出伪足，呈三角形，细胞生长密集且数量多，如图1所示（正常组）；经400μmol/L过氧化氢损伤后的模型组细胞生长受到抑制，细胞体积变小并且数量明显减少，折光弱；随着毛蕊花糖苷给药剂量的增加，细胞数量逐渐增加，尤其是毛蕊花糖苷高剂量组细胞基本恢复正常。

图1 细胞形态学观察

2.2 毛蕊花糖苷对TM3细胞生长的影响

以25、50、100μg/ml的毛蕊花糖苷F12培养液处理氧化损伤后TM3细胞24小时后，各组细胞存活率详见图2。

图2 毛蕊花糖苷对TM3细胞生长的影响

随着毛蕊花糖苷浓度的增加，吸光度(A值)略有增高，其中毛蕊花糖苷中剂量组和毛蕊花糖苷高剂量组与模型组比较，差异显著（P＜0.05）。

3 结论

通过体外培养睾丸间质细胞（TM3），在培养环境中加入H2O2制备TM3氧化应激损伤模型，并检测毛蕊花糖苷对TM3氧化应激损伤后作用。结果显示，毛蕊花糖苷对培养的TM3细胞无毒性作用，25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷对细胞的生长无明显抑制作用，而且还具有一定的促进增殖趋势。25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷对氧化损伤具有明显的保护作用，且呈浓度依赖。

4 结语

随着时代的发展，人们比起以前更加关注自身的健康状况，不孕不育这一重要问题也日益被人所关注，发病率趋势逐年增加，其发病原因、影响因素已成为全球性生殖医学的研究热点。

男性不育症的病因很多，目前已经明确许多因素与男性不育症明显相关，如性腺功能低下、精索静脉曲张、感染、免疫性不育、输精管梗阻所致不育、隐睾症等[9-10]，应用针对病因的药物或者手术治疗可以取得比较满意的治疗效果，男科医生在这些方面的治疗已经积累了不少经验。但是仍有相当一部分男性不育症的病因不明，目前现有的技术手段不能找出病因的不育症，即特发性男性不育症，约占男性不育症的31.6%[11-12]，对这类不育症的治疗目前只是经验性的，而且疗效不确定，治疗机制也多不明了，从而给西医治疗带来了难度。

睾丸间质细胞是睾丸中一种能特异性产生男性雄激素的细胞，这对男性的生育能力和精子发生的维护至关重要，本研究结果为男性不育的药物治疗提供了新思路,为研究毛蕊花糖苷的生精作用研究奠定了基础。