枣仁茯苓玉竹膏改善阴虚型失眠作用研究

黄晓巍，王 宇，王亚杰，周 佳，王晋冀，律广富，谢晓燕，辛 国*

（1.长春中医药大学东北亚中医药研究院，长春 130117；2.长春中医药大学药学院，长春 130117；3.长春中医药大学附属医院后勤保障部，长春 130021）

失眠是普遍存在于女性和老年人中的睡眠障碍，严重者可干扰正常的生活活动[1]。有资料显示[2]，我国患有失眠的人口高达38%，且有年轻化趋势。数据显示，阴虚型失眠占比为22.83%[3]。现代医学认为失眠的发病机制与5-HT、DA、NE、γ-GABA、Glu有关[4]，针对失眠的治疗以苯二氮卓类药物为主，而中药治疗失眠历史悠久，且副作用小。枣仁茯苓玉竹膏由枣仁、茯苓、玉竹、龙眼、甘草组成，均为药食同源中药。枣仁宁心安神为君药；茯苓、龙眼裨益心脾、养血安神为臣药；佐以玉竹滋阴降火；甘草调和诸药为使。水煎液是临床常用的提取溶剂，本研究选择水为提取溶剂，并对其改善阴虚型失眠的作用进行研究，为中医药改善失眠的深入研究提供理论依据。

1 材料

1.1 实验药品及主要试剂

1.2 主要仪器

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1.3 动物

ICR小鼠，SPF级，60只，雌雄各半，体质量18g~22 g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号码:SCXK(吉)2018-0007；SD大鼠，SPF级，雄性60只，体质量180g~220 g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号码：SCXK(吉)2018-0007。

2 方法

2.1 戊巴比妥钠阈下催眠剂量试验

2.1.1 动物分组与给药

小鼠共分为6组，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组、枣仁茯苓玉竹膏高、中、低剂量组。其中阳性对照组给予天王补心丸0.26丸/天，枣仁茯苓玉竹膏高、中、低剂量组分别给药5g·kg-1、10g·kg-1和20g·kg-1（按生药剂量折算），其余组小鼠给予等体积蒸馏水，连续给药一周。

2.1.2 行为学实验

末次给药30min后，小鼠自主活动测试仪测试每组小鼠自主活动次数，完成后每组小鼠腹腔注射28mg·kg-1戊巴比妥钠，记录每组小鼠入睡鼠数，计算每组小鼠入睡率（入睡率=每组小鼠入睡个数÷每组小鼠总数×100）。

2.2 枣仁茯苓玉竹膏对阴虚型失眠模型大鼠的影响

2.2.1 动物分组与给药

大鼠共分为6组，分别为空白对照组、模型组、阳性对照组、枣仁茯苓玉竹膏高、中、低剂量组。其中阳性对照组给予天王补心丸0.18丸/天，枣仁茯苓玉竹膏高、中、低剂量组分别给药5g·kg-1、10g·kg-1和20g·kg-1（按生药量折算），空白对照组、模型组给予等体积蒸馏水，连续给药3周。

2.2.2 动物造模

除空白组外其他组在灌胃给药2周后腹腔注射甲状腺素0.5mg·kg-1，连续给药1周。

2.2.3 旷场实验

给药3周结束后，将大鼠放于旷场中适应3min，通过开场活动实验系统，记录每只大鼠2min内总移动路程。

2.2.4 体质量

测定每只大鼠体质量。

2.2.5 饮水量、进食量

每只日摄食量=（上次加入的饲料总量-剩余饲料量）/（大鼠只数×间隔天数）

每只日饮水量=（上次加入的水总量-剩余水量）/（大鼠只数×间隔天数）

2.2.6 肛温

体温计测量每只大鼠肛温，以温度计的数值恒定不变为标准。

2.2.7 ELISA法检测大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH、血浆中cAMP、cGMP含量

大鼠血清和血浆样品在-4℃的条件下低温离心15min，吸取上清液，于-80℃条件下保存备用。严格按照试剂盒说明书测定大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、Glu、TSH、血浆中cAMP、cGMP含量。

2.2.8 Western Blot法检测大鼠脑组织中CRH、ACTH表达水平

取各组大鼠脑组织0.1g，按北京索莱宝提供的全蛋白提取试剂盒说明书提取各组大鼠脑组织总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒对样品进行蛋白定量，调节蛋白浓度为8.580 g·L-1；将蛋白样品与等体积5×样品缓冲液混合后，100℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷却；将样品加入到放置好SDS-PAGE胶的加样孔内，每孔加样20μL，110V恒定电流转膜60 min。转膜结束后，取出PVDF膜，采用TBST洗涤3次，每次5 min，之后将膜放入5%脱脂奶粉中，水平摇床，室温下封闭1 h。封闭结束后，将膜取出，TBST浸洗1次10min，浸洗2次，每次5 min，向洗膜盒中加入相应的一抗CRH（1∶1000）、ACTH（1∶5000）稀释液，4℃储存，过夜。加HRP标记二抗（1∶5000），水平摇床，室温封闭1 h，TBST浸洗3次，每次5min。加入ECL发光液，室温孵育膜1 min。将膜正面朝上放到凝胶成像仪内，照相、记录结果。对电泳条带进行灰度值扫描，对各目的蛋白进行半定量分析。以目的条带与Beta Actin灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达量[5]。

2.3 统计学方法

所有结果采用SPSS 22.0统计软件进行统计处理，各指标采用单因素方差分析，结果用（±s）表示，多组均数组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 戊巴比妥钠阈下剂量试验

实验结果表明，与空白组比较，模型组动物活动次数、站立次数、小鼠入睡率没有明显变化(P＜0.05)；与模型组比较，阳性对照组与枣仁茯苓玉竹膏高剂量组动物活动次数、站立次数明显减少，小鼠入睡率明显增加(P＜0.05)，但枣仁茯苓玉竹膏中剂量组和低剂量组相关指标与模型组相比差异并不明显。详见表1。

表1 各组小鼠自主活动次数和入睡率结果(±s，n=10)Table 1 Mice spontaneous activity frequency and sleep rate results of each group(±s,n=10)

表1 各组小鼠自主活动次数和入睡率结果(±s，n=10)Table 1 Mice spontaneous activity frequency and sleep rate results of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.2 旷场实验

实验结果表明，与空白组比较，模型组动物静止时间明显减少，运动时间、总移动路程明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，阳性对照组、枣仁茯苓玉竹膏高剂量组、中剂量组动物静止时间明显增加，运动时间、总移动路程明显减少(P＜0.01)，枣仁茯苓玉竹膏低剂量组静止时间和运动时间有明显变化，总移动路程无明显 差异(P＜0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠旷场实验结果(±s，n=10)Table 2 Rat open field experiment results of each group(±s,n=10)

表2 各组大鼠旷场实验结果(±s，n=10)Table 2 Rat open field experiment results of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.3 体质量

实验结果表明，各组大鼠给药前体质量无明显差异；与空白组比较，模型组大鼠给药2周后，体质量明显增加，给予造模药后，体质量明显下降(P＜0.01)。与模型组比较，各给药组2周后体质量明显增加，给予造模药后，阳性对照组大鼠体质量明显增加，枣仁茯苓玉竹膏高剂量组、中剂量组体质量明显下降，低剂量组大鼠体质量下降不明显(P＜0.01或P＜0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠体质量结果(±s，n=10)Table 3 Results of body mass of each group(±s,n=10)

表3 各组大鼠体质量结果(±s，n=10)Table 3 Results of body mass of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.4 饮水量、进食量

实验结果表明，除空白组和模型组外，各给药组大鼠在2周内饮水量明显增加；第3周，与空白组比较，模型组大鼠饮水量增加，阳性对照组和高剂量组饮水量有下降趋势(P＜0.01，P＜0.05)。各组大鼠2周内进食量没有明显变化，在第3周，与空白组比较，模型组大鼠进食量明显增加，与模型组比较，各给药组大鼠进食量明显减少(P＜0.01或P＜0.05)。详见表4—5。

表4 各组大鼠饮水量结果(±s，n=10)Table 4 Results of water consumption of each group(±s,n=10)

表4 各组大鼠饮水量结果(±s，n=10)Table 4 Results of water consumption of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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表5 各组大鼠进食量结果(±s，n=10)Table 5 Results of food intake of each group(±s,n=10)

表5 各组大鼠进食量结果(±s，n=10)Table 5 Results of food intake of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.5 肛温

实验结果表明，各组大鼠在造模前肛温无明显差异；造模后，与空白组比较，模型组大鼠肛温明显增加，与模型组比较，阳性对照组、枣仁茯苓玉竹膏高剂量组肛温明显下降(P＜0.01或P＜0.05)。详见表6。

表6 各组大鼠肛温结果(±s，n=10)Table 6 Results of anal temperature of each group(±s,n=10)

表6 各组大鼠肛温结果(±s，n=10)Table 6 Results of anal temperature of each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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3.6 ELISA检测结果

ELISA检测结果表明，与空白组比较，模型组大鼠血清中5-HT、γ-GABA、血浆中cGMP含量明显降低，DA、NE、Glu、TSH、血浆中cAMP表达水平明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，阳性对照组、枣仁茯苓玉竹膏高剂量组大鼠血清中5-HT、γ-GABA、血浆中cGMP明显升高，DA、NE、Glu、TSH、血浆中cAMP均有明显降低(P＜0.01或P＜0.05)。详见表7。

表7 各组大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH和血浆中cAMP、cGMP含量结果(±s，n=10)Table 7 Results of 5-HT,DA,NE、γ-GABA、GLU、TSH in serum and cAMP、cGMP in plasma of rats in each group(±s,n=10)

表7 各组大鼠血清中5-HT、DA、NE、γ-GABA、GLU、TSH和血浆中cAMP、cGMP含量结果(±s，n=10)Table 7 Results of 5-HT,DA,NE、γ-GABA、GLU、TSH in serum and cAMP、cGMP in plasma of rats in each group(±s,n=10)

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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续表7

3.7 Western Blot检测结果

Western Blot检测结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠脑组织中CRH、ACTH表达水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠脑组织中CRH、ACTH含量均有明显降低（P＜0.01）。详见表8，图1。

图1 各组大鼠脑组织中CRH、ACTH表达电泳图Figure 1 Electrophoresis of CRH and ACTH expression in brain of rats in each group

表8 各组大鼠脑组织中CRH和ACTH水平（n=3,±s）Table 8 Expression levels of CRH and ACTH in brain of rats in each group

表8 各组大鼠脑组织中CRH和ACTH水平（n=3,±s）Table 8 Expression levels of CRH and ACTH in brain of rats in each group

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01，#P＜0.05。

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4 讨论

通过腹腔注射戊巴比妥钠催眠阈下剂量试验，分别测定每组小鼠的自主活动和入睡率，结果表明，枣仁茯苓玉竹膏明显减少小鼠自主活动，提高小鼠入睡率，具有协同戊巴比妥钠催眠的作用。

甲状腺[6]是人体最大的分泌腺，其功能是合成分泌甲状腺激素。甲状腺激素的主要作用是促进物质与能量代谢，促进生长与发育过程，提高基础代谢率，使产热和氧耗量增加。给予大鼠过量的甲状腺素，大鼠饮水量、进食量、肛温明显升高，体质量明显减少，在旷场实验中，大鼠静止时间明显减少、运动时间和总移动路程明显增加，动物出现中医阴虚证并有交感神经兴奋性增强的特点，从而制备甲状腺功能亢进引起的阴虚失眠动物模型。药天王补心丸，能缓解阴虚型失眠动物的症状[7]。给予大鼠滋阴药治疗后，观察各项临床指标。结果表明，给予枣仁茯苓玉竹膏后，症状和行为表现均有所改善，其趋势与天王补心丸阳性对照组一致。

环核苷酸[8]是调节细胞功能活动的重要物质。cAMP是由ATP经腺苷酸环化酶及Mg2+的作用生成的，cAMP能对细胞内很多代谢过程发生影响，如肾上腺素、肾上腺皮质激素释放激素等。当甲状腺功能亢进时，机体内的cAMP、TSH进一步升高，cGMP降低，因而出现基础代谢增强[9]。血浆cAMP含量升高，表明机体代谢受到一定程度影响；Western Blot结果显示，ACTH、CRH表达明显升高，说明下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴功能受到影响。当给予枣仁茯苓玉竹膏治疗后，以上检测指标均有所改善。表明枣仁茯苓玉竹膏对甲状腺激素所致阴虚型失眠引起的代谢增强及HPA轴功能紊乱有一定的改善作用。

睡眠的发生机制与神经递质5-HT、DA、NE、γ-GABA及Glu等有关，本实验通过检测血清中含量，发现模型组大鼠血清中5-HT、γ-GABA含量明显降低，DA、NE、Glu含量明显升高，给药后，各组大鼠血清中神经递质含量均有明显改变，提示枣仁茯苓玉竹膏可能是通过改善神经递质含量，从而改善睡眠。

综上所述，枣仁茯苓玉竹膏对甲状腺功能亢进阴虚型失眠所致基础代谢增强[10]和HPA轴功能紊乱有一定调节作用，在减少机体的基础代谢率，改善症状、体征、行为表现和失眠相关神经递质方面有一定作用。本文初步探讨了枣仁茯苓玉竹膏对失眠动物行为学、相关神经递质及激素的影响，其具体的作用机制仍有待于进一步研究。