太子参水煎液对T2DM大鼠肠道短链脂肪酸含量的影响

黄雅婷，阚永军，朱妍锦，胡 娟*

（1.福建中医药大学药学院，福州 350122；2.福建省中医药科学院，福州 350003）

糖尿病是严重威胁人类健康的慢性代谢性疾病之一，我国糖尿病患病人群以T2DM（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）为主，T2DM是由于胰岛β细胞分泌的缺陷和胰岛素抵抗导致机体糖代谢异常引起血糖升高的疾病[1]。有研究表明，肠道菌群对宿主代谢的有益影响通常被认为是由短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）所介导的；SCFAs的增加可能是预防或缓解T2DM的潜在治疗方法[2]。

近年来，随着现代医学对肠道菌群深入研究，发现T2DM的发生/发展与肠道菌群有着密切关系，肠道微生物稳态失衡导致菌群多样性遭到破坏，进而引起肠黏膜慢性炎症反应，干扰葡萄糖的吸收与代谢，进而影响T2DM的发生/发展[3]。SCFAs是肠道微生物重要代谢产物，主要存在于结肠，包括乙酸，丙酸，丁酸等[4]。大量研究证明SCFAs与机体的代谢过程息息相关，在维持机体能量代谢方面起着重要作用[5]。丙酸在肝脏中被代谢为乙酰辅酶a，进入TCA循环转化为ATP和NADH促进葡萄糖产生，调控机体糖异生[6]。Perry R J等证实乙酸被肠道吸收后，通过血液循环进入血脑屏障，增强大脑循环的能力，激活副交感神经刺激β细胞胰岛素的分泌[7]。SCFAs被视为机体能量代谢的关键调节因子之一，SCFAs的变化间接反映肠道微生物代谢状态[8]。

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterohylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根。具有益气生津、补气润肺的功效，主要用于脾虚体倦、气阴不足等症[9]。补气养阴是中医治疗消渴病的途径之一，因此太子参被广泛应用于抗糖尿病的药方中[10]。本课题前期研究发现，太子参可以降低T2DM大鼠空腹血糖、血清IL-6、TNF-α含量，升高IL-10水平，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗[11-13]。中药多以汤剂的形式进行口服给药，主要经胃肠道吸收，发挥疗效[14]。本研究拟通过腹腔注射STZ联合高脂高糖饲料喂养建立T2DM大鼠模型，灌胃给予太子参水煎液，采用气相色谱法测定结肠内容物中SCFAs的含量，探讨太子参水煎液对T2DM大鼠结肠内容物SCFAs代谢的影响。

1 仪器与材料

1.1 仪器

GC-2014型气相色谱仪（日本岛津公司）；AE240S型分析天平（梅特勒-托利多有限公司）；STRATOS型低温高速离心机（美国Thermo公司）；DK-98-ⅡA型水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；色谱柱HP-INNOWAX（30 m×0.25μm×0.32 mm），DW-86L728J超低温冰箱（青岛海尔）。

1.2 试剂

乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、2-乙基丁酸均为色谱纯（上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇（色谱纯，德国默克公司）；水为超纯水。

1.3 药材

太子参药材（柘参3号，批号：ZS3-202001）购于海诚药业太子参种植基地。

2 实验方法

2.1 太子参水煎液的制备

称取太子参药材150 g，剪成0.3~0.8 cm小段，加超纯水800 mL，浸泡30 min，武火加热煮沸10 min后改文火加热1 h，稍冷后过滤，滤渣再加超纯水800 mL，同法煎煮1 h，过滤后合并两次滤液，滤液减压浓缩至500 mL，得太子参水煎液，浓度为0.3 g/mL。

2.2 给药与分组

取SPF级Wistar大鼠20只，体重（220±20）g，雌雄各半，适应性喂养7 d。随机选取5只作为正常对照组，正常自由饮食饮水，其余大鼠以高脂高糖饲料和普通育成饲料梯度混合后进行适应性过渡饲养7 d后，腹腔注射1%STZ（0.35 mL/100 g），诱导T2DM大鼠模型。3 d后，实验动物禁食不禁水4 h，尾静脉取血检测血糖水平，血糖＞11.1 mmo1/L，则判定为T2DM大鼠模型。剔除造模未成功的大鼠，将造模成功大鼠分为模型组和太子参水煎液组，每组不少于5只，太子参水煎液组每日给予太子参水煎液（1 mL/100 g），模型组和正常对照组给予相同容量生理盐水，持续干预时间为45 d。

2.3 结肠内容物中短链脂肪酸的测定

2.3.1 混合标准溶液的配制

准确称取乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、庚酸标准品适量，用甲醇定容，得到浓度分别为50、33.2、8.32、33.2、16.6、25、50和5.6 mg/mL单标准品储备液，另外配制0.125 mg/mL的2-乙基丁酸（内标）溶液，分别精密吸取各标准品储备液适量，用甲醇稀释定容，得到浓度为乙酸2.5 mg/mL、丙酸1.66 mg/mL、异丁酸0.0416 mg/mL、丁酸1.66 mg/mL、异戊酸0.083 mg/mL、戊酸0.125 mg/mL、己酸0.25 mg/mL、庚酸0.028 mg/mL的混合标准品溶液，逐级稀释，得到一系列浓度梯度的混合标准品溶液。

2.3.2 样品采集与供试品制备

结肠内容物的采集：腹腔注射0.3%戊巴比妥钠（1 mL/100 g）进行麻醉，无菌环境采集结肠内容物，采集的样本立刻放置于液氮内，后转移至-80°C低温冰箱保存。

供试品制备：精密称取0.1000 g肠内容物于EP管中，加入1 mL甲醇和100μL 0.125 mg/mL的2-乙基丁酸，涡旋30 s，离心5 min（10000 rpm，4°C）；取上清液于EP管，加入100μL 50 mmol/L盐酸，涡旋30 s，离心5 min（10000 rpm，4°C），取上清液，供气相色谱仪分析。

2.3.3 气相色谱条件

色谱柱：HP-INNOWAX（30 m×0.25μm×0.32 mm）；进样口温度：250°C；进样体积：0.5μL；载气：高纯氮气（≥99.999%），载气流速3.0 mL/min；检测器（FID）温度：280°C；升温条件：初始温度70°C，保持2.5 min后，以4°C/min的速度上升至200°C，保持5 min；分流模式：不分流。

2.4 方法学考察

精密度：取同一份混合标准品溶液，在“2.3.3”项条件下，连续进样6次，记录各成分的峰面积，计算相对标准偏差RSD%；

重复性：取同一份样品，按照“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3.3”项条件下分析，记录各成分的峰面积，计算相对标准偏差RSD%；

稳定性：取同一份供试品溶液，分别于0、2、4、6、8和12 h时进样，在“2.3.3”项条件下分析，记录各成分的峰面积，计算相对标准偏差RSD%；

加样回收率：精密称取样品0.0500 g，分别按已测的质量分数100%加入8种SCFAs标准品，按“2.3.2”项下方法制供试品溶液，平行制备6份，在“2.3.3”项条件下分析，记录各成分的峰面积，计算加样回收率平均值及加样回收率RSD%。

2.5 数据分析

3 结果

3.1 方法学考察结果

3.1.1 混合标准品溶液和供试品溶液的GC图谱

混合标准品溶液和供试品溶液的气相色谱（GC）图谱如图1和图2所示，8种SCFAs及内标物2-乙基丁酸分离度良好，分离度大于1.5，符合GC色谱含量测定的要求。

图1 混合标准品溶液的气相色谱图

图2 供试品溶液的气相色谱图

3.1.2 标准曲线及线性范围

8种SCFAs的标准曲线和线性范围如表1所示，标准曲线相对拟合系数R2均大于0.998，表明8种SCFAs在相应的质量浓度范围内线性关系良好。

表1 8种SCFAs的线性回归方程、线性范围及相关系数

3.1.3 精密度试验

8种SCFAs峰面积的RSD值在0.77%~2.50%之间，均小于5%，结果表明该方法精密度良好。

3.1.4 重复性试验

8种SCFAs峰面积的RSD值在0.48%~2.41%之间，均小于5%，结果表明该方法的重复性良好。

3.1.5 稳定性试验

8种SCFAs峰面积的RSD在1.30%~2.33%之间，均小于5%，表明供试品溶液在12 h内具有较好的稳定性。

3.1.6 加样回收试验

结果如表2所示，8种SCFAs的平均回收率在93.65%~100.94%之间，RSD为1.24%~2.60%。

表2 8种SCFAs的加标回收试验结果

3.2 太子参水煎液对结肠内容物中SCFAs含量的影响

SCFAs与肠道健康和代谢密切相关。表3和图3反映了太子参水煎液对T2DM大鼠肠内容物中SCFAs的影响；各组大鼠肠道内容物中乙酸、丙酸、丁酸的含量最高。模型组大鼠结肠内容物中丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、己酸含量显著低于空白组（P＜0.05）；与模型组相比，水煎液组大鼠结肠内容物中丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸含量显著增加（P＜0.05）。

图3 太子参水煎液对T2DM大鼠肠内容物中SCFAs的影响

表3 大鼠肠道内容物中SCFAs的含量（ng/mg）（n=5,±s）

表3 大鼠肠道内容物中SCFAs的含量（ng/mg）（n=5,±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

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研究显示，丁酸浓度与糖尿病风险的增加呈负相关，丁酸是肠上皮细胞的主要能量来源，同时可以抑制炎症因子的释放，减少肠道慢性炎症反应的发生，维持肠道微生态的平衡[15,16]；而太子参水煎液可以显著增加丁酸含量（P＜0.05）。乙酸是肠道厌氧菌的主要代谢物，参与机体的糖代谢[15,17]；丙酸参与肝脏脂肪酸代谢，抑制胆固醇合成[18-20]，太子参水煎液对T2DM大鼠结肠内容物中乙酸、丙酸含量并无影响。

4 讨论

SCFAs具有较强的挥发性、亲水性等特点，因此选择合适的SCFAs前处理的方法尤为重要。对SCFAs样品进行前处理的方法有：水提法、超滤法、萃取法等[21,22]。为了能够减少样品在前处理过程中的损失，并快速准确的测定结肠内容物中SCFAs样品的含量，本文经过反复摸索，对SCFAs提取方法进行优化，采用酸水提取法；该方法操作简单，省去了样品衍生化的繁琐步骤，节省了样品前处理时间。本研究建立GC方法测定T2DM大鼠结肠内容物中SCFAs的含量并对其进行方法学考察，结果显示，8种SCFAs均具有良好的线性，且精密度、重复性及稳定性均符合气相色谱法的分析要求，说明该方法可用于T2DM大鼠肠内容物中SCFAs的含量测定。

大量研究表明，SCFAs与T2DM之间存在着一定的联系，SCFAs经肠道吸收进入血液循环，进一步参与肝脏的葡萄糖代谢和脂肪酸代谢[23]；脂肪酸代谢发生异常，会降低胰岛素敏感性，引起胰岛素抵抗的发生，从而对T2DM产生影响[24]。丁酸通过诱导GLP-1的产生，调节胰岛素的分泌，改善血糖的稳态，延缓T2DM的病程[25]；Xu等探讨了丁酸对2型糖尿病潜在的治疗作用，结果表明丁酸盐可以通过恢复肠道微生物组成以及肠道屏障的完整性来改善T2DM症状[26]。研究显示，肠内容物中SCFAs含量的减少，会改变肠道微生物的生态平衡，影响机体各项代谢活动[27]；糖尿病小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸的含量显著低于正常组，降糖治疗后，糖尿病小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量显著提高[28]。SCFAs在维持健康和疾病发展中发挥着重要作用。本实验研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠结肠内容物中丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、己酸含量显著降低（P＜0.05），太子参水煎液可显著增加T2DM大鼠结肠内容物中丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸的含量（P＜0.05），表明太子参水煎液可影响T2DM大鼠结肠内容物中SCFAs的代谢；而SCFAs是肠道微生物重要代谢产物，因此太子参水煎液的干预可能影响T2DM大鼠肠道微生物的多样性和稳定性。然而，太子参水煎液通过何种途径影响肠道菌群，进而影响SCFAs的代谢，尚需进一步探讨研究。