复方万年青胶囊与顺铂注射液联用对肝癌荷瘤小鼠免疫功能的影响

石 菊，佟志军，于艳辉，宋德库，曲笑锋，唐晓桐，徐 建，鄢必新*

（1.吉林修正药业新药开发有限公司，吉林 130103；2.吉林天立泰药业有限公司，吉林 134400）

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的消化系统肿瘤，死亡率居恶性肿瘤的第3位，中国是肝癌的高发国家，其患者总量约占全球的55%。肝癌具有起病隐匿、病情发展迅速、易转移、患者生存期短等特点，目前临床治疗主要根据肝癌的不同阶段进行个体化综合，主要包括手术、放化疗等[1]。顺铂注射液是临床应用较广泛的抗肿瘤药物，其副作用主要为消化道反应、肾脏毒性、骨髓抑制以及听神经毒性，导致临床治疗效果并不十分理想。随着现代中医学对肿瘤研究的深入，中药联合化疗药物抗肿瘤的优势日益凸显，不仅能够提高化疗药物的疗效，还可以减轻化疗药物的不良反应。复方万年青胶囊以虎眼万年青为主要成分，配以人参、黄芪、全蝎等制成，解毒化瘀，扶正固本。适用于肺癌、肝癌、胃癌化疗合并用药，具有减毒增效作用的中药抗癌药物。目前已被用于对肺癌、肝癌、胃癌的辅助治疗，在改善免疫系统、治疗肿瘤、抗氧化等方面发挥重要作用，有利于改善化疗药物对病人的损伤。本研究探讨了复方万年青胶囊与顺铂注射液联合应用治疗肿瘤以及减缓化疗药物毒副作用影响，为肝癌的更深一步研究治疗提供帮助。

1 实验材料

1.1 实验动物

BALB/c小鼠168只，SPF级，雌雄各半，体重18-22g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[合格证号：SCXK（吉）2020-0002]。

1.2 实验药品与试剂

复方万年青胶囊（吉林天立泰药业有限公司，0.4g×36s）；顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，6mL:30mg×5支/盒）；碘伏（德州德新康消毒制品有限公司）；印度墨汁（源叶生物有限公司）；碳酸钠（北京化工厂）；乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子（TNFα）、白介素-2（IL-2）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 细胞株

人慢性骨髓性白血病K562细胞（赛百康），小鼠肝癌H22细胞（北纳创联）。

2 实验方法

2.1 制备肝癌H22细胞悬液

小鼠腹腔接种H22瘤液后，待腹部出现明显的腹水处死，仰卧固定，消毒皮肤，用眼科剪小心剥离表皮，露出外膜，抽取腹腔肿瘤积液，以0.9%氯化钠注射液稀释，调整细胞浓度至2.0×106个/mL，放在冰浴中备用。

2.2 模型复制及分组给药[2-4]

将BALB/C小鼠随机分为7组：空白组、模型组、化疗药对照组（7mg/kg）、复方万年青胶囊1倍临床剂量对照组（0.5g/kg）、复方万年青胶囊3倍临床剂量对照组（1.5g/kg）、复方万年青胶囊1倍临床剂量+顺铂注射液联用组（0.5g/kg+7mg/kg）、复方万年青胶囊3倍临床剂量+顺铂注射液联用组（1.5g/kg+7mg/kg），每组24只，雌雄各半。除空白组以外，其余组将制备的腹水瘤液，注射在小鼠右前肢腋窝，缓慢注射0.2mL瘤液后迅速拔针，之后用棉签在针口按压数秒，防止瘤液流出，进行建模[5-6]。24h后，空白组、模型组小鼠于造模第二天腹腔注射0.9%氯化钠溶液10mL/kg，1次/14d；顺铂注射液对照组于造模第二天腹腔注射顺铂注射液，1次/14d；复方万年青胶囊对照组灌胃给药，每天1次；联用组于造模第二天腹腔注射顺铂注射液，同时分别灌胃给药，每天1次。连续灌胃给药14d。实验期间动物自由进食和饮水，观察小鼠一般情况。

2.3 对荷瘤小鼠抑瘤率、脏器指数和腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响

每组取12只小鼠末次给药后1h，称体重，各鼠均按0.1mL/10g剂量由尾静脉注入印度墨汁（以生理盐水按1∶5稀释），注射后分别在1min（t1）、10min（t2）从小鼠眼眶静脉丛取血20μL溶于2.0mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀，放置20min后680nm处测其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液做空白对照，将小鼠处死后取肝脏，剥离瘤块并称取瘤质量，按公式（1）计算抑瘤率，同时剥离脾脏称质量，按公式（2）计算脾脏指数。

根据公式计算廓清指数K值和吞噬指数α值[7、8]。

式中：t1、t2分别为取血时间；A1、A2分别为在时间t1、t2时所取血样对应的吸光度。

2.4 合并用药疗效的计算[9]

根据Webb氏分数乘积法计算(fa)1,2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]，(fa)1和(fa)2分别为两药的抑瘤率，(fa)1,2为计算的理论相加效应。若联合用药的效应大于理论相加效应，则表示有协同作用。

2.5 对荷瘤小鼠血清酶学指标的影响

采集每组剩余小鼠外周血，放置于-80℃保存，用于随后的检测。通过酶联免疫试剂盒检测免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α），相关操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.6 对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响[10-12]

2.6.1 脾细胞悬液的制备

每组剩余小鼠脱颈椎处死，剪开肌层无菌取脾，置于预冷PBS的培养皿中，剥离剩余脂肪和胰腺。剪碎脾脏通过70μm细胞过滤器以收集单细胞悬浮液。将细胞悬浮液1500rpm，5min离心后用Gey's溶液裂解红细胞，静止3min后再次离心。反复裂解离心直至无红色沉淀，用PBS重悬即收获脾细胞悬液。

2.6.2 NK细胞活性测定

对K562细胞以及脾细胞进行活细胞计数。将100μL K562细胞作为靶细胞（2.5×106个/mL）加入到96孔培养板的每个孔中。将100μL脾淋巴细胞用作效应细胞（1×107个/mL）添加至每个测试孔。同时设最大释放孔及空白对照孔，每组有2复孔。即：

测 试 孔：K562 100μL+脾细胞 100μL

空白对照孔：K562 100μL+RPMI1640 100μL

最大释放孔：K562 100μL+LDH释放剂（稀释后）100μL

细胞于37℃、5%CO2条件下培养4h后使用LDH测定试剂盒测量LDH水平。基于公式计算NK细胞的细胞毒率：

式中ODtest表示试验孔的吸光度，ODmin表示空白对照孔的吸光度，ODmax表示最大释放孔的吸光度。

2.7 统计分析

实验数据用SPSS 19.0软件统计分析，结果用均值±标准差表示，P＜0.05具有统计学差异。

3 实验结果

3.1 对荷瘤小鼠抑瘤率、脏器指数和腹腔巨噬细胞吞噬作用的影响

结果表明，与空白组比较，模型组荷瘤小鼠脾脏系数非常显著升高（P＜0.01），胸腺系数非常显著降低（P＜0.01），吞噬指数α显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，复方万年青胶囊3倍临床剂量+顺铂注射液联用组荷瘤小鼠脾脏系数极显著降低（P＜0.001），吞噬指数α非常显著升高（P＜0.01），复方万年青胶囊1倍临床剂量+顺铂注射液联用组荷瘤小鼠脾脏系数极显著降低（P＜0.001），吞噬指数α升高，但无统计学差异（P＞0.05）。详见表1。

表1 对肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率、脏器指数和吞噬指数的影响（X±S，n=12）

3.2 对荷瘤小鼠抑瘤率和合并用药疗效的影响

结果表明，各给药组抑瘤率分别为43.2%、7.1%、12.7%、64.7%、71.7%，根据Webb氏分数乘积法计算，复方万年青胶囊3倍临床剂量+顺铂注射液联用组理论相加效应为50.4%，实际为71.7%，说明与顺铂注射液联用有协同作用。复方万年青胶囊1倍临床剂量+顺铂注射液联用组理论相加效应为47.2%，实际为64.7%，说明与顺铂注射液联用有协同作用。详见表2。

表2 对肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响（X±S，n=12）

3.3 对荷瘤小鼠血清酶学指标的影响

结果表明，与空白组比较，模型组荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM、IgG活性均有不同程度升高（P＜0.05，P＜0.001）；与模型组比较，复方万年青胶囊3倍临床剂量+顺铂注射液联用组荷瘤小鼠血清中TNFα、IL-2、IgM、IgG活性不同程度降低（P＜0.01，P＜0.001），复方万年青胶囊1倍临床剂量+顺铂注射液联用组荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM、IgG活性不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。详见表3。

表3 对肝癌H22荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM和IgG活力的影响（X±S，n=12）

3.4 对荷瘤小鼠NK细胞杀伤率的影响

结果表明，与空白组比较，模型组荷瘤小鼠NK细胞杀伤率明显降低，但由于标准差较大，没有统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，各给药组荷瘤小鼠NK细胞杀伤率不同程度升高（P＜0.05，P＜0.001），其中复方万年青胶囊3倍临床剂量+顺铂注射液联用组荷瘤小鼠NK细胞杀伤率达到102%，高于其他给药组。详见表4。

表4 对小鼠NK细胞杀伤活性的影响（X±S，n=12）

4 讨论

复方万年青胶囊以清热解毒药虎眼万年青、半枝莲、虎杖、白花蛇舌草为君，以补气升阳药人参、丹参、黄芪为臣，以郁金、全蝎、蜈蚣为佐使进行配伍，具有解毒镇痛、散结消肿的功效，清热解毒的同时，补气升阳、活血止痛，调节机体免疫功能。

肝细胞癌是高度恶性肿瘤之一，目前手术切除仍是其治疗的主要手段，而术后复发、转移乃是治疗失败的主要原因。而且大多数化疗药物缺乏肿瘤细胞特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时，对包括免疫细胞在内的分裂增殖旺盛的正常细胞具有杀伤作用，影响巨噬细胞等免疫细胞正常的增殖活化，从而引起机体免疫功能的抑制，严重影响到恶性肿瘤的治疗[13-14]。因此，调节机体免疫功能，增强化疗药物疗效，降低其不良反应，尤其是预防治疗患者化疗后出现的免疫功能抑制，是有效改善食管癌患者生存条件的关键。有临床研究表明，恶性肝癌者IgG、IgM含量与正常水平有明显升高，Ig上升与肿瘤细胞学特点存在关联性，细胞学存在分泌不正常或者血清成分不正常情况，或者可以提高体液Ig含量，据此，研究者表示癌细胞不正常分泌或者其诱导的其它体液不正常状态是引发体液免疫反应的关键，最终通过测定可直接发现部分Ig上升[15]。

本研究采用BALB/c小鼠的腋下移植瘤模型，研究复方万年青胶囊的免疫调节作用及对顺铂注射液的增效减毒作用[16-17]。研究结果表明，小鼠接种H22瘤株以后，会出现精神状态萎靡、被毛光泽度低、日常活动次数减少，脾脏系数增加，腹腔巨噬细胞吞噬功能下降等免疫抑制状态。复方万年青胶囊和顺铂注射液联合治疗后，小鼠精神状态逐渐改善，被毛光泽度增高，日常活动次数增加，联用药组优于中药对照组。脾脏系数明显降低，腹腔巨噬细胞的吞噬能力明显提高。同时，复方万年青胶囊联合顺铂注射液组荷瘤小鼠血清中IgG、IgM含量明显降低并趋于正常水平，且炎性因子TNF-α活性明显降低，其肿瘤生长速率明显变缓，小鼠一般情况明显改善。二者联合应用与理论效应值比较，说明复方万年青胶囊对顺铂注射液的癌症治疗具有增效减毒作用，能够显著地提高癌症治疗效率并调节免疫功能。该研究为复方万年青胶囊临床应用提供了有力的实验数据支持。