中药复方补肾益脑丸对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力障碍的改善作用及其机制

刘 娟，王知斌，王秋红,2，刘祥成，匡海学*

（1.黑龙江中医药大学，教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，哈尔滨 150040；2.广东药科大学中药学院，广东省中药饮片规范化炮制工程技术研究中心，广州 510006；3.牡丹江灵泰药业股份有限公司，牡丹江 157011）

阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)，又称为老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性。临床主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能[1]。阿尔茨海默病是临床中所占比重最大的一种痴呆类型，其发病率与死亡率随年龄的增长而不断加重，且该病具高致残性，已发展为导致老年人死亡的第五大病因[2]。根据临床表现，老年痴呆属于中医学“呆证”“善忘”“郁证”“癫狂”“不慧”“愚痴”等病症，认为年老体衰，肾精亏虚，五脏不足，脑髓渐空，痰浊上蒙，瘀阻脑络为本病的基本病机。中医认为肾藏精，精能生髓，脑为髓海，如肾精不足，髓海空虚，会导致痴呆。因此肾精亏虚所致的髓海不足是AD发病的关键[3]。临床中该病多为虚实交错，病症错杂，虚、瘀、痰互见[4]。而“补肾”作为治疗该疾病的基本原则，在该疾病治疗过程中贯穿始终[5]。一方面肾虚为主的五脏虚衰可导致痰浊、瘀血等的产生，即因虚而致实；另一方面，痰瘀为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，此所谓因实而致虚。两者互为因果，形成恶性循环，以致病程缠绵，见症多端。有研究显示[6]其发病可能是由遗传、环境、代谢等多种复杂因素相互作用所致。

补肾益脑丸由16味药组成，具有补肾生精，益气养血的作用。用于肾虚精亏、气血两虚所致的心悸、气短、失眠、健忘、遗精、盗汗、腰腿酸软、耳鸣耳聋。有研究表明[7-8]，中医药在AD的防治上具有副作用小、多环节、多靶点、多途径的整合效应，能够通过多途径发挥疗效。因此，研究中药复方补肾益脑丸治疗阿尔茨海默症作用对于传统中药复方的二次开发，挖掘其抗阿尔茨海默病药效潜力具有重要意义。

1 实验材料

1.1 实验动物

72只SPF级ICR小鼠，雌雄各半。体质量为22-25g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号NO.SCXK（辽）2020-0001。本实验所有操作均符合动物实验伦理要求。

1.2 药物与试剂

补肾益脑丸（牡丹江灵泰药业股份有限公司，产品 批 号：190703、200501、200902、200903、201201、210302）；盐酸多奈哌齐片（卫材药业有限公司，10mg/片，批号1911040）；Aβ1-42（北京博奥森生物技术有限公司，货号bs-0107p，批号BJ02263853）；注射用青霉素钠（哈药集团制药总厂，产品批号20110628-2）；碘伏；小鼠白细胞介素6(IL-6)、小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、小鼠环氧合酶2(COX-2)、小鼠白细胞介素1β(IL-1β)、小鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA试剂盒（均购自江苏酶免实业有限公司，货号分别为MM-0163M2、MM-0132M2、MM-0356M2、MM-0040M2、MM-0758M2、MM-0389M2）。

1.3 仪器

DW-200型脑立体定位仪(成都泰盟科技公司)；泰盟TM-Vision行为学实验系统（WMT-100 Morris水迷宫视频分析系统（白鼠版））；低温冰箱（海尔DW-86L626）；微量进样器（上海安亭微量进样器厂，规格10μL）；医用真丝非吸收缝线（扬州市金环医疗器械厂，规格型号3-0，生产批号20200103）；脱脂棉球（阳谷景阳岗卫生材料厂）；普通止血钳（张家港市锦丰锦鹿刀剪厂，规格12.5cm直，苏苏食药监械（准）字2007第1010051号）；酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司，型号：RT-6100）；电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司，型号：BPS-50CL）；洗板机（北京天石，型号：ZMX-988B）；微量高速离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司，仪器型号：TG16W）；高速组织研磨仪（武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-II）；正置白光拍照显微镜（Nikon（Japan）型号Eclipse Ci-L）；扫描浏览软件（3DHISTECH（Hungary）型号CaseViewer2.4）。

2 实验分组及给药

2.1 实验分组

72只ICR小鼠(雌雄各半)适应性饲养一周后，按体质量和性别随机分为假手术组（Control）、模型组（AD model）、盐酸多奈哌齐组（Donepezil）、补肾益脑丸低剂量组（BSYNW-L）、补肾益脑丸中剂量组（BSYNW-M）和补肾益脑丸高剂量组（BSYN-W-H），每组12只。

350mg/kg乌拉坦麻醉小鼠后，固定，剪去头部毛，碘伏、酒精消毒头部皮肤。切开小鼠头部皮肤约2cm,找到卤门位置，以卤门为原点，向右移动1mm,向后移动0.5mm,深度为3mm,10min内微量进样器缓慢注射3μl老化的Aβ1-42(5μg/μl)，弥散5min。消毒后伤口处涂抹适量青霉素钠粉末，缝合伤口。置于鼠笼中饲养，术后前5d给予青霉素(1次/d)，以避免感染,同时注意术后保暖。假手术组注射等体积无菌生理盐水。

2.2 给药

补肾益脑丸高、中、低组给药剂量分别为1.44、0.72、0.36g/kg和盐酸多奈哌齐组（1.5mg/kg），每日一次灌胃给药。取等量6个批次的补肾益脑丸，打成极细粉并将其充分混合均匀，盐酸多奈哌齐同样打成粉末备用。连续给药60天,假手术组和模型组小鼠灌胃等体积蒸馏水。

2.3 水迷宫定位航行实验

行为学测试采用Morris水迷宫来测试小鼠的空间学习和记忆能力。小鼠接受BSYNW治疗60d后，随机每组选取6只小鼠(雌鼠3只雄鼠3只)进行为期6d的训练并用图像跟踪软件记录其游泳路径。用统计学分析软件分析寻找逃生平台的潜伏期。水迷宫主体是一个白色圆形水池(直径120cm，高50cm)，在测试期间，圆形水池中装满了水并加入脱脂奶粉，池子被分成四个等面积的象限(1、2、3和4)。将平台(高25cm，直径10cm)放置于目标象限的正中心，让其淹没在水面以下1cm处。实验时将小鼠背向平台放置于平台所在目标象限的对角象限，共计时60s，各组小鼠依次进行训练。若60s的时间内小鼠找到平台，则记录该时间为此小鼠的逃避潜伏期，让小鼠在平台上停留10s后将其擦干放回笼中，若60s内小鼠未找到目标平台，则引导该小鼠到达平台，此小鼠逃避潜伏期记为60s。

2.4 水迷宫空间探索实验

定位航行检测结束后24h,即第7天，将透明平台撤去，将小鼠背向平台放置于目标象限对角象限边缘，使其自由运动60s,期间要记录各小鼠穿越平台次数和进入平台所在目标象限累计时间。所有实验的过程中均要保持周围环境安静，且其他参照物的位置不能随意挪动。

2.5 酶联免疫吸附试验考察小鼠血清中炎症因子、氧化应激相关因子的表达

行为学实验结束后，小鼠眼球取血后断头处死，4℃135000r/min条件下离心20min后分离血清，留下待检测样本后，其余-80℃保存备用。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.6 HE染色检测小鼠海马CA1区、CA3区病理形态学变化

断头处死小鼠后，低温无菌条件下快速取出整个脑组织，用冰冷等渗盐水冲洗，从脑中线将脑组织分为左右半脑，以4%多聚甲醛溶液固定48h，自来水冲洗24h，脱水透明后石蜡包埋HE染色。其余的脑保存在-80°C以作进一步分析。将切片放入白矾中浸泡5min，用自来水冲洗，然后进行伊红染色1min。切片在上升式酒精溶液中脱水，用二甲苯使其透明，然后密封。用德国Leica DM3000LED光学显微镜检测海马CA1区、CA3区的病理变化，并用Motic MED6.0数字医学图像分析系统进行分析。然后于显微镜下进行镜检并拍照，并按病理评分标准分别进行病理形态学评分。评分标准见表1[9]。

表1 海马CA1区、CA3区组织病理学评分标准

2.7 统计学分析

3 结果

3.1 补肾益脑丸对AD小鼠学习记忆能力的影响

由图1显示结果可知，随着训练天数的增加，各组小鼠的逃避潜伏期均有不同程度的缩短。实验数据显示从第三天开始阿尔茨海默症模型组小鼠的逃避潜伏期与其它各组小鼠相比较都有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。说明补肾益脑丸可有效改善老年痴呆动物模型空间记忆能力的减退，并且表现出剂量依赖性。其中，与Control组相比，AD model组小鼠逃避潜伏期时间明显延长（P＜0.01），BSYNW-H组的小鼠逃避潜伏期较AD model组的潜伏期降低明显（P＜0.01），BSYNW-L组和BSYNW-M组小鼠的逃避潜伏期也有不同成度的缩短（P＜0.01或P＜0.05）。

图1 Morris水迷宫定位航行实验中各组小鼠的逃避潜伏期

图2 Morris水迷宫空间探索实验中各组小鼠代表性运动轨迹图

图3 补肾益脑丸对阿尔茨海默症小鼠学习记忆功能的影响（左：各组小鼠正确穿越平台区域次数；右：各组小鼠进入平台象限累计时间）

Morris水迷宫空间探索实验结果显示，与Control组相比，AD model组小鼠在目的象限的累计停留时间明显缩短，准确穿越平台所在位置的次数也较少，均具有显著性差异（P＜0.01）。与AD model组相比较，BSYNW-H组和Donepezil组小鼠在目标象限的累计停留时间明显延长（P＜0.01，P＜0.05），准确穿越原平台所在位置的次数明显增加（P＜0.01）。说明补肾益脑丸对于改善阿尔茨海默症模型小鼠的空间学习记忆能力具有良好疗效。

3.2 补肾益脑丸对AD小鼠血清中炎症因子和氧化应激因子水平的影响

由图4、图5酶联免疫吸附试验检测结果显示：AD model组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量升高，SOD与GSH-PX含量降低，与control组比较均有显著性差异（P＜0.05）。与AD model组比较，BSYNW-H组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量均降低，而SOD和GSH-PX含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与AD model组比较，BSYNWM组和BSYNW-L组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6含量也有不同成度的降低，SOD与GSH-PX含量则有不同程度的升高，且呈剂量依赖性。其中BSYNW-M组小鼠血清IL-6水平与AD model组比较也具有显著差异（P＜0.05），说明补肾益脑丸可以抑制阿尔茨海默病模型小鼠血清中炎性因子的释放，增加其相关抗氧化因子的释放，说明其药物作用机制可能与抗炎、抗氧化作用有关。

图4 各组小鼠血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2、IL-6的表达

图5 各组小鼠血清中氧化应激相关因子超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的表达

图6 小鼠海马CA1区HE染色结果（×200）

图7 小鼠海马CA3区HE染色结果（×200）

图8 各组小鼠海马组织病理形态学评分结果

3.3 BSYNW对AD小鼠海马组织病理学改变的影响

观察到AD model组小鼠海马CA1区、CA3区神经元有明显的细胞病理学改变，包括锥体细胞排列紊乱，变薄，细胞体积缩小，细胞间隙变大，形状不规则。神经细胞排列紊乱且数量也明显减少，极度明显可见细胞固缩及空泡化，与Control组相比，其病理形态学评分明显上升;与AD model组相比，补肾益脑丸各给药组小鼠海马神经细胞数量明显增多、排列紊乱状态有所改善、细胞固缩及空泡化现象明显缓解，病理形态学评分明显降低。其中，与AD model组相比，BSYNW-H组和Donepezil组小鼠海马CA1区、CA3区细胞仅有少量细胞病理改变，而正常小鼠则不存在这种改变。光镜下观察发现，注射Aβ1-42后，AD model组小鼠海马CA1区、CA3区神经元数量较Control组明显减少，说明补肾益脑丸对于改善AD模型小鼠海马病理形态学损伤具有良好的作用。

4 讨论

中医将AD归属于“痴呆”“神呆”等范畴，病机与五脏虚弱，脑髓生成乏源或脑络不通，脑髓不纯有关，脑气凝滞皆由气血不畅所致，脑与脏腑之气不接，脑中气血亏虚或不通是痴呆的关键病机[10]。中医认为肾主骨，骨生髓，脑为髓之海，肾精足则记忆力增强，行动轻捷。当肾精亏耗导致髓海空虚，则出现痴顽呆滞，行作笨拙。因此肾虚、髓海不足是导致AD的重要原因[11]。另一方面肾主气化是肾脏生理功能的高度概括，也是中医阴阳平衡理论的体现，肾之精气上达，化髓冲脑，灌髓海此为阳，下降之浊气则排出体外此为阴，阴阳互根互用，相互对立制约，处于一种动态的平衡[12]。

海马是中枢神经系统的重要组织，主要参与学习、记忆、情感等高级生理功能[13]。海马神经元损伤可影响海马功能，最终演变为学习障碍、记忆功能障碍、抑郁和颞叶癫痫等，是阿尔茨海默病表现出的病理特征之一。通过抑制海马损伤，改善海马神经可塑性，一定程度上可达到缓解阿尔茨海默病症状的效果[14]。

神经炎症在神经退行性疾病中也起着重要作用[15-16]。神经炎症是发生于脑内的炎症反应，可由多种因素导致，如脑创伤、β-淀粉样蛋白沉积、能量代谢障碍，甚至是衰老[17]。有研究显示大量释放促炎因子会损害神经元，并引起突触丧失和神经元死亡，与患者病情发生相关，其在评估阿尔茨海默症病况中有重要作用[18]。

研究发现，老年痴呆患者体内抗氧化能力下降、自由基堆积，是造成神经细胞毒性的重要原因，进而影响学习记忆功能[19]。SOD和GSH-PX是体内重要的抗氧化酶，在学习记忆能力障碍患者体内的活性下降，自由基大量产生，引起脑组织功能受损[20]。

历代文献和现代报道统计发现，熟地黄、川芎、远志、茯苓、当归均是老年痴呆治疗的高频使用中药[21]，单味中药的现代药理学研究亦为上述中药治疗痴呆提供了作证[22-24]。同时国际中医临床实践指南也推荐肾虚血瘀的老年痴呆症患者可选用山楂枸杞饮泡水代茶，经常饮服[25]。而中药复方补肾益脑丸中含有16味中药，极大的涵盖了可用于治疗肾虚髓亏型老年性痴呆的多种单味药[26]，推测其整体药效会更加良好。本实验结果也显示，补肾益脑丸对于阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力、炎性因子表达、氧化应激相关因子表达及海马病理形态学变化均产生了积极影响，原因可能是此复方中的大部分单味药在治疗阿尔茨海默症中均有较好疗效，联合应用效果更佳。

综上所述，补肾益脑丸在治疗阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力、减少相关炎症因子表达、抗氧化应激以及改善海马病理形态学损伤的实验中均取得了较好疗效，说明其具有缓解阿尔茨海默病的巨大潜力，接下来应该更进一步深入研究其中药复方的药效物质基础，广泛探寻其可能的作用机制，为更加广泛的临床应用提供可靠的实验依据。