超高效液相色谱法快速检测稻米中的维生素B1

李滑滑，杨 静，沈 娜，洪 玲，曾奎杰，张晓燕，梅 广，黄 力

（湖南省粮油产品质量监测中心/稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410201）

维生素B1在人体生长发育过程中扮演着重要的角色，不仅以辅酶的形式参与糖的分解代谢，还能起到保护神经系统的作用[1-3]。随着《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》的实施[4]，维生素B1成为了评价稻米营养品质的重要指标之一。日本、美国等国家都非常重视稻米中维生素的含量，并相继研究开发出许多高维生素含量的稻米食品[5-6]。

当前，稻米中维生素B1常采用的检测手段是普通的高效液相色谱法[7-9]，但随着液相色谱系统颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高，近年建立的填料粒径＜2 μm的超高效液相色谱系统，因其超高分离度、超快速度、超高灵敏度等优点，得到研究者的广泛关注[10-12]。本研究拟对GB 5009.84—2016《食品安全国家标准 食品中维生素B1的测定》[13]第一法高效液相色谱法前处理过程中的水解及中和条件进行优化，采用超高效液相色谱快速测定稻米中维生素B1的含量，以期为基层实验室大批量稻米样品中维生素B1检测提供高效快速准确的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Acquity uplc 超高效液相色谱仪：沃特世公司；BL-75G型立式压力蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；202-2AB型电热恒温干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；盐酸硫胺素（C12H17ClN4OS·HCl）（纯度≥97.0%）：北京索莱宝科技有限公司；稻谷：某粮库扦取；大米：市场采购；木瓜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg） ：北京百奥莱博科技有限公司；淀粉酶（酶活力≥3 700 U/mg） ：上海联迈生物工程有限公司；正丁醇(优级纯) ：广州市锦旺化工有限公司；铁氰化钾（优级纯）： 艺康化工（湖北）有限公司。

1.2 维生素B1标准溶液的配制

准确称取盐酸硫胺素标准品57.8 mg，相当于50 mg硫胺素，用0.01 mol/L盐酸溶液溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成500 μg/mL的维生素B1标准储备液，于0～4 ℃冰箱保存。临用前，用水稀释，得维生素B1质量浓度分别为0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00 μg/mL标准工作溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BHC C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：甲醇（A）和0.05 mol/L乙酸钠水溶液（B）；等度洗脱条件：35% A和65% B；流量：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；激发波长：375 nm；发射波长：435 nm；运行4 min。

1.4 样品加标

取稻谷样品用砻谷机脱壳制成糙米，经精米机脱糠粉制成精米（达三级大米以上），用高速旋转粉碎机粉碎后，制得均匀一致的粉末，称取5.00 g样品分别放入100 mL锥形瓶中，添加一定量的维生素B1标准储备液，使其样品中维生素B1的实际添加含量分别为0.20、0.80、1.40 mg/100 g，避光，室温过夜。

1.5 样品提取与衍生化

1.5.1 样品提取

称取5.00 g样品（试样制备参照1.4）置于100 mL锥形瓶中，加入60 mL 0.1 mol/L 盐酸溶液，充分摇匀，塞上软质塞子，在恒温干燥箱中于121 ℃保持30 min，水解结束冷却至40 ℃以下取出，轻摇，加入7 mL 2.0 mol/L乙酸钠溶液，加入3.0 mL混合酶溶液（称取3.52 g木瓜蛋白酶，2.54 g淀粉酶，加水定容至100 mL，摇匀，使其呈混悬状液体），摇匀后，置于培养箱中37 ℃过夜，将酶解液全部转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，过滤，取上清液备用。

1.5.2 样品衍生化

准确移取上述上清液2.0 mL于10 mL试管中，加入1.0 mL碱性铁氰化钾溶液，涡旋混匀后，准确加入2.0 mL正丁醇，再次涡旋混匀，离心（转速4 000 r/min，5 min），待充分分层后，吸取正丁醇相(上层)经0.45 μm有机微孔滤膜过滤，供超高效液相色谱分析用。

另取2.0 mL标准系列工作液，与试液同步进行衍生化。

2 结果与讨论

2.1 水解及中和条件的优化

本研究选取2个不同梯度的样品（1号大米样品、1号糙米样品），同一种样品6份，3份一组做平行试验，分别考察在高压灭菌锅和恒温烘箱中（121 ℃保持30 min ）进行水解，测定维生素B1的含量，结果见表1。由表可知，利用恒温烘箱水解测得的稻米中维生素B1含量与高压灭菌锅水解法的基本一致。

表1 2种水解方法测得的样品中维生素B1含量（n=3） mg/100 g

GB 5009.84—2016中指出：“用pH计指示，用2.0 mol/L 乙酸钠溶液调节pH至4.0左右”。本研究通过前期试验发现，一次性加入7 mL 2.0 mol/L乙酸钠溶液均可达到相应的效果。通过对水解及中和条件的优化，避免了高压灭菌锅必须由专人操作而带来的不便，一次性加入乙酸钠溶液中和酸液有效地缩短了前处理时间，可以实现批量检测，大大提高检测效率。

2.2 方法的线性范围、检出限和定量限

按照优化后的色谱条件，在维生素B1标准工作液（0.020～1.000 μg/mL）范围内取7个点，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线。试验结果表明，维生素B1含量在0.020～1.000 μg/mL的范围内线性关系良好，线性方程为Y=2.76E+007X-4.55E+005，相关系数大于0.999。并以S/N=3、S/N=10分别计算维生素B1的检出限和定量限，求得其检出限为0.4 μg/100 g，定量限为1.3 μg/100 g，能满足稻米中维生素B1含量的测定要求。

2.3 方法的回收率与精密度

以1号大米样品（0.11 mg/100 g）为基体，添加维生素B1标准储备液，按1.4、1.5样品前处理方法及1.3色谱条件进行回收率试验，每个添加水平做6次平行，考察方法的回收率和精密度，结果见表2。

由表2可知，添加水平在0.20、0.80、1.40 mg/100 g时，平均回收率为85.0%～98.6%，相对标准偏差为1.5%～4.6%，表明该方法准确性良好。

表2 方法的回收率和精密度（n=6）

2.4 超高效液相色谱与高效液相色谱的比较

利用改进的样品前处理方法，通过超高效液相色谱仪快速测定稻米中维生素B1含量，获得1号大米样品与1号糙米样品色谱图如图1所示。

由图1可知，在1.3的色谱条件下，超高效液相色谱能快速地将稻米中维生素B1检测出来，其保留时间在0.85 min左右。而GB 5009.84—2016中的高效液相色谱法在其相应的色谱条件下，保留时间约4 min，并且室温条件下衍生产物在4 h内稳定，这都不利于日常的批量检测。因此，采用超高效液相色谱测定稻米中维生素B1更快且更适合批量样品检测。

图1 超高效液相色谱测定稻米中维生素B1的色谱图

此外，对比图1中大米与糙米样品色谱图发现测得的维生素B1保留时间稳定且峰形良好，超高效液相色谱可以很好地对稻米中维生素B1进行定量分析。

2.5 大米与糙米样品的比较

为更好地了解维生素B1在稻谷籽粒中的分布情况，从粮库中扦取5份稻谷样（样品编号：1～5号大米样品、1～5号糙米样品），市场购买5份不同品牌的大米样（样品编号：6～10号大米样品），每份样品进行3次平行试验，结果见表3。

由表3可知，稻谷在加工过程中维生素B1会有较大的损失。稻谷通过精米机脱糠粉制得大米，大米中的维生素B1含量只占糙米中的30.8%～42.9%。大米经抛光等加工工艺处理后其维生素B1含量会进一步减少。由此可见，稻米中维生素B1含量主要存在于糠粉层中，这与相关研究文献[5-7]的结果一致。

表3 大米与糙米样品中维生素B1含量及两者百分比（n=3）

3 结 论

本研究利用恒温烘箱水解法代替高压灭菌锅水解法，测得的维生素B1含量与国标方法无显著性差异；一次性加入乙酸钠溶液简化了酸碱的中和步骤；采用超高效液相色谱测定稻米中维生素B1，其保留时间稳定且峰形良好，可以很好地对稻米中维生素B1进行快速定量分析，在0.02～1.00 μg/mL范围内呈现良好线性关系，相关系数大于0.999，检出限为0.4 μg/100 g，定量限为1.3 μg/100 g，回收率为85.0%～98.6%，精密度均小于5%。该法能有效地缩短检测时间，实现批量检测，提高了检测效率，可满足基层实验室大批量稻米样品中维生素B1快速准确测定的需求。另外，稻米中维生素B1主要存在于糠粉层中，随着稻米加工精度的提高，稻米中维生素B1含量显著下降，因此后续应对如何保存稻米中维生素B1开展研究。