卵胞浆内单精子注射技术精子优选方法的研究进展

邵帅，江梅，丁涛，姜经航，王开秀，王婷婷，向翠玲

(湖北省荆门市第二人民医院 1.生殖医学科；2.创伤-骨肿瘤外科，荆门 448000)

全球约有10%～15%的不孕不育夫妇，这些病例中约50%与男性有关，原因不明的男性不育的发生率约为15%[1]。卵胞浆内单精子注射(ICSI)是通过注射针将选择的形态正常的单个精子注射到卵母细胞内使其受精的技术。自然受精是精子进入生殖道，去除精浆、穿透宫颈粘液、获能、前进到输卵管壶腹部，与卵子结合受精并通过一系列反应穿过卵丘细胞层、透明带和卵膜等极其严格的选择过程，就是为了选择最有活力、DNA完整性好、成熟的精子与卵母细胞结合，得到高质量的胚胎[2]。ICSI则绕过了所有的自然选择屏障(卵丘细胞层、透明带和卵膜)。虽然ICSI对注射的精子要求比较高，通过将精子放大200～400倍，甚至放大到6 000倍观察并选择形态正常的精子，但只能有效选择形态正常的精子，而有些形态正常的精子，其DNA完整性比较差，碎片比较多[3]。因此，从ICSI胚胎质量以及临床结局角度考虑出发，本文从进行ICSI时精子的选择方法作一综述，以便为临床ICSI提供有效参考。

一、低渗肿胀试验

低渗透肿胀试验(HOST)最初作为精子的诊断试验，对精子质膜的功能完整性进行评估。在低渗条件下，精子尾部由于水的进入而出现正常的功能膜膨胀或卷曲，目前在临床实践中作为精子存活的可靠指标[4]。HOST可用于睾丸或附睾穿刺取出的精子、睾丸切开显微取精的精子以及少弱精子症患者手淫法取出的精子等，通过该方法可以筛选出完全不动但有活力的精子。Bloch等[5]通过HOST将精子按A到G进行分类，发现经HOST选择的精子与未经选择的精子相比较，HOST分类为B类和B+类的精子质量最高(低DNA碎片，低DNA去浓缩，端粒间距离短，染色体1区域小)。Casper等[6]通过HOST选择不活动但有活力的精子，与随机选择精子相比，受精率从26%提高到43%，卵裂率从23%增加到39%。Charehjooy等[7]研究表明HOST的应用可以使胚胎具有更高的发育潜力、着床率以及妊娠率。此外，在IVF完全受精失败的下一个ICSI周期中使用HOST，可以获得更好质量的精子。

以上研究表明了HOST的有效性，并建议将其作为行ICSI之前的常规操作。尽管尚未有研究证明HOST的有害作用，但胚胎实验室在决定使用HOST时，应该考虑其实践运用、使用标准，并与患者签订相关知情协议。

二、激光辅助不动精子选择

激光辅助不动精子选择(LAISS)是在行ICSI之前高倍视野下选择形态较好的不动精子，在靠近精子尾巴尖端处激光射击，存活精子在射击后精子尾部会立即出现卷尾或折角现象，但此方法不会对精子DNA造成损害。国内研究显示LAISS能有效筛选睾丸中存活的不动精子，改善ICSI的实验室结局，提高其正常受精率、优质胚胎率、囊胚形成率等[8]。LAISS可以有效鉴别极重度弱精子的存活情况，这些存活的极重度弱精子通过ICSI可以达到与正常精子ICSI相同的受精率，而且有助于提高卵裂率和优质胚胎率，但激光导致精子尾部卷曲的机制尚不清楚，可能与激光照射后介质流入精子尾部有关[9]。2017年报道了一例使用LAISS技术选择的完全不动但存活的冷冻复苏精子，进行ICSI受精后成功妊娠的病例，为数量较少的不动精子的处理提供了新的思路[10]。Ozkavukcu等[11]通过LAISS提取抗己酮可可碱的静止精子进行ICSI，移植双囊胚后获得健康的三胞胎。也有其他研究显示LAISS-ICSI与传统的ICSI相比，虽然能够提高卵母细胞存活率，但囊胚形成率、质量和利用率均下降[12]。

就目前文献所显示的冲突结果，LAISS-ICSI似乎不是提高ICSI成功率的最佳解决方案，仍需要大量的研究来证实LAISS-ICSI的成功率。也需要更多的研究和改进措施来阐明LAISS作为行ICSI前不动精子常规选择的潜力及激光对胚胎发育的潜在影响机制。

三、偏振光显微镜选择精子

成熟精子的细胞核具有固有的双折射，偏振光显微镜就是根据精子双折射现象对精子进行选择。精子头的双折射可以作为反映其细胞核正常结构组织的指标。双折射也可以评估顶体反应的状态，因为成熟的精子在整个头部表现出双折射，而发生顶体反应的精子仅在顶体后区存在双折射[13]。Magli等[14]发现位于顶体后区的双折射与反应性顶体以及DNA完整性密切相关，是成熟精子的可靠指标。此外，双折射模式与精子活力和正常形态之间有一定的相关性，形态异常或活力差的精子具有异常双折射模式，且形态与双折射特性的关联性更强[14]。ICSI时选择偏振光下存在双折射的精子，受精后原核评分为Z1和Z2的显著多于非选择组，而且弱精子症患者的精子行ICSI时，通过双折射选择精子得到的妊娠结局比HOST选择的精子得到的妊娠结局更好[15]。2008年，Gianaroli等[16]利用双折射选择精子进行ICSI，与传统ICSI方法相比，通过偏光显微镜选择的精子可以获得更好的胚胎发育和临床结局。两年后，该小组基于顶体完整性(发生顶体反应和未发生顶体反应的精子)及其与辅助生殖技术(ART)结果的关系评估了双折射模式的作用，认为发生顶体反应的精子和未发生顶体反应的精子的受精率和胚胎发育均没有显著差异，但注射发生顶体反应的精子可以获得更高的着床率和临床妊娠率[17]。

尽管取得了这些成果，但还需要进一步的研究来验证该方法。另外，对精子头部双折射模式的评估是基于形态学检查，需要熟练的胚胎学家正确地执行这项技术。

四、运动精子细胞器形态学检查

运动精子细胞器形态学检查(MSOME)是一种通过超高倍显微镜将精子放大6 000倍后，对精子超微结构进行评估的技术。精子超微结构包括精子顶体、顶体后板层、细胞核、颈部、尾部和线粒体，其中精子的细胞核是影响ICSI结果的主要超微结构。由此在MSOME基础上出现ICSI 的改良版，即形态选择精子胞浆内单精子注射(IMSI)。IMSI已被证明是一种有效的技术，用于某些特定的患者群体的精子选择。有研究比较了少弱精子症和畸形精子症的患者分别采取ICSI和IMSI技术的妊娠结局：与ICSI组相比，IMSI组患者的妊娠率和活产率有上升趋势，生化妊娠率和着床率也较高[18]。史艳彬等[19]研究显示，与ICSI相比，IMSI能够提高优胚率，降低胚胎非整倍体率。与ICSI相比，IMSI所选精子的DNA碎片更少且凋亡转录基因水平更低，IMSI组的胚胎动力学和着床率、临床妊娠率和活产率等临床结局均要优于ICSI组[20]。

其他研究也显示与ICSI相比，IMSI在不影响胚胎染色体状态的前提下，显著提高了胚胎质量和着床率，降低了流产率；由于IMSI在对精子的选择过程中更准确，所以正常染色体的囊胚形成率高于ICSI。毫无疑问，IMSI技术的使用可以帮助一些不育夫妇生育孩子，但对于方法的效率以及如何执行IMSI的具体指南尚未达成共识。目前，不建议在ART项目中常规使用IMSI，IMSI仅适用于多次植入失败的夫妇、严重男性因素致不孕的患者、高龄男性和高龄产妇等人群[21]。而且IMSI的临床实践没有足够的证据支持，需要进一步的试验来阐明其有效性和安全性。

五、透明质酸介导的精子选择

卵母细胞周围含有透明质酸(HA)，成熟精子在质膜和体膜中表达HA结合糖蛋白，负责结合和消化HA。HA受体的表达可作为一种生物标志物，用于选择和分离成熟精子进行ART。

基于HA介导的精子选择技术有两种，即生理性胞浆内单精子注射技术(PICSI)和富含HA培养基的筛选技术。PICSI技术是通过一个有HA涂层的培养皿进行ICSI；富含HA培养基的筛选技术是将一滴洗涤过的精子样本放置在HA液滴附近，使两液滴之间有一个接触区，精子会停留在两个液滴的界面，选择其中结合了HA的精子进行ICSI。研究显示通过HA结合实验优选的精子，其正常形态率、获能2 h酪氨酸磷酸化、诱发顶体反应以及核蛋白成熟度显著增高，而DNA碎片率显著降低[22]。在严重畸形精子症夫妇中，PICSI组的受精情况和胚胎质量均显著优于ICSI组[23]。2019年，一对夫妇使用通过HA结合的成熟圆头形精子进行ICSI成功受孕，并成功分娩，婴儿健康[24]。McDowell等[25]的研究表明，虽然没有观察到不良反应，但没有足够的证据来验证HA选择的精子可以改善ART结果，仍需要进一步的研究来评估HA为基础的方法是否可以推荐用于临床实践。

六、磁性活化细胞分选法

磁活化细胞分选(MACS)是用磷酯酰丝氨酸与膜联蛋白V(annexin-v)包被磁珠，进行凋亡与非凋亡精子的选择。磷脂酰丝氨酸是一种带负电荷的磷脂，存在于体细胞和精子的质膜内层，在细胞凋亡早期阶段，它被外部化到细胞外层，与annexin-v结合。研究表明MACS技术可以有效地用于清除精子DNA碎片(SDF)较高的精子，MACS组在供卵周期中的妊娠率、自体和卵母细胞捐献周期中的活产率均显著提高，自体ICSI周期中的流产率降低，因此，MACS可能有助于改善ART结局[26]。有报道利用MACS技术从卡塔根氏综合征患者射出的不动精子中优选精子，然后通过ICSI技术受孕并成功分娩健康婴儿[27]。

Jeyendran等[4]研究显示，与PICSI组比较，MACS组患者受精胚胎质量、着床率、临床妊娠和持续妊娠率等均无显著差异；根据女性年龄进行亚组分析时，年龄<30岁亚组中，MACS组的优质囊胚率、临床妊娠率、持续妊娠率均显著高于PICSI组(P<0.05)，但在30～35岁亚组中，PICSI组拥有较高的植入率、临床妊娠率和持续妊娠率。但MACS是否有临床实践价值，以及关于哪些患者应该应用仍不确定。

七、电动电位法

成熟精子的膜具有-16～-20 mV的电位，这是由精子发生和附睾成熟过程中的唾液糖蛋白产生的，这种负电位可以作为成熟精子的标志物。随着精子获能，其电位下降，因此成熟的精子可以粘附在带正电荷物体的表面。电动电位法就是基于这一原理，先将精液标本用培养基冲洗，再将精子悬液加到新的带正电荷的玻璃离心管中(离心管置于乳胶手套内并旋转2～3次，以获得正电荷)，为使成熟精子有足够的时间粘附于试管壁，将试管室温静置1 min，然后离心丢弃不粘附的精子，用含血清的培养基中和试管上的电荷，获得成熟的精子。也可以使用商业化电动电位分析仪，通过施加电场，具有电荷的精子将向电极迁移，它们移动的速度与场强和电势成正比。常规ICSI中精子选择是基于形态和活力，这并不一定排除将DNA受损或凋亡的精子注射到卵母细胞中，电动电位法可以尽可能避免这一缺陷。

电动电位法和密度梯度离心法(DGC)回收的精子进行比较，两种方法得到的精子的相对端粒长度和绝对端粒长度均无显著性差异，但电动电位法制备的精子的平均DNA碎片率显著低于DGC法[28]。DGC法和电动电位法的结合可以选择磷酯酶Cζ(PLCζ)较高百分比的精子群体，这些精子包含大量的PLCζ并且染色质完整，这种精子选择程序可以为以前受精失败的不育男性开辟一种新的途径[29]。与传统DGC法相比，电动电位法不仅提高了胚胎质量，而且改善了妊娠结局；尽管电动电位法选择后的X/Y比例相近，但电动电位组的出生性别比(XY/XX)显著低于DGC组[30]。此外，电动电位法回收率低，导致其在少精子症或睾丸穿刺精子回收的情况下使用有限[31]。

电动电位法的主要优点在于它的简便和廉价，所选择的精子DNA片段较少、形态正常、活力和运动性好。但仍需要更多的研究来阐明电动电位法是否改变了新生儿性别比例。

八、电泳法选择精子

与电动电位法相似，电泳法选择精子也是基于成熟精子的质膜带负电荷。电泳法是将精液样本置于电泳装置中，然后施加电压选择带负电荷的精子。电泳选择精子技术可以根据精子的大小和负电荷，从未成熟、功能失调的生殖细胞和白细胞中分离出精子。该装置包括两个内室，用于精子的接种；两个外室，用于收集选定的精子；两个电极和两个缓冲泵。内、外室由聚碳酸酯膜隔开，成熟的精子可以穿过，而较大的细胞被阻挡，这样就可以获取存活、活动、形态正常以及DNA损伤程度较低的精子。该方法适用于严重少、弱精子症以及睾丸穿刺精子等的精子选择。

电泳分离的精子活力和形态均优于Percoll梯度离心精子，生成的活性氧(ROS)更少，而且在睾丸或附睾穿刺精子中显示出更低水平DNA损伤[32]。在对精子处理分析时，电泳法获取的精子DNA损伤率低于DGC，获取的精子质量与受精率、植入率和和囊胚发育呈正相关；而且有通过电泳法获取高质量的精子受精后成功分娩的报道[33-34]。鉴于电动电位法对性别比例有一定的影响，Ainsworth等[35]也对电泳法的性别比例进行了研究，结果显示电泳方法处理的精液，并没有导致携带X或Y的精子的比例发生显著变化。但有一些证据表明电泳法对精子活力存在负面影响，且使用电泳可能会引起一些安全问题[4]，故仍需要更多的研究来确定该方法在临床实践中的有效性。

九、精子的微流体分离

微流体是一种基于受控环境中亚微升水平上流体行为的物理和化学原理的新技术，这项技术用于遗传学到ART技术的多个领域。微流体在精子选择中的潜在效用已经取得了重大进展，研究显示该技术从混合细胞悬浮液中回收精子的回收率>96%，大大提高穿刺取出精子的恢复时间，从人工观察的几个小时恢复提高到自动精子恢复的几分钟，处理时间提高了36倍；此外，精子微流处理对精子参数如精子的活力、形态以及DNA碎片没有显著影响；将微流体用于不动精子获取可以极大地改进目前的睾丸精子提取的处理程序，简化操作流程，从而保证手术成功[36]。微流体精子处理提供了一种替代传统精子分离的技术，可以从未处理的样品中分离出前向运动的精子，虽然通过微流体的处理会降低精子浓度，但改善了精子的运动性和活力以及降低精子DNA碎片率(DFI)水平，反映了该技术的高度选择性[37]。

通过对微流体和直接上游法获取的精子分别进行ICSI的移植结局比较，发现微流体获得的精子受精后优质胚胎率较高，植入率以及临床妊娠率均高于直接上游法[38]。Yetkinel等[39]显示微流体系统的使用改善了胚胎质量，但与传统的精子上游法相比，受精率、临床妊娠率以及活产率并没有显著差异。需要进一步的研究来评估微流体的潜力及其在ART中的临床应用。目前，这项技术大多以研究为主要目的，临床应用的适用性较低。

十、总结

基于新的数据和对人类精子的更深理解，先进的精子选择方法慢慢被开发出来，各种新技术都有其优缺点及适应证(表1)。新技术需要超越传统精子选择方法，解决更复杂的情况。尽管使用这些先进的精子选择方法已经被证明可以改善ART结局，但大多数研究仍处于胚胎层面，随后的发育和临床结局需要进一步研究，以验证其在临床实践中的有效性。

表1 精子优选方法的适应症及优缺点