基于网络药理学探讨怀膝颗粒治疗骨质疏松症的作用机制

林禹澎，黄凤辉，徐雅娟，解生旭，姜英子※

（1.延边大学药学院，吉林 延吉 133002；2.葵花药业集团（吉林）临江有限公司，吉林 临江 134600；3.吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012）

随着世界人口老龄化的加剧，骨质疏松症（osteoporosis,OP）、高血脂症等一系列难以治愈的疾病不断困扰着老人们，有关数据显示，OP的发病率正呈逐年上升趋势[1,2]，其严重影响了老人们的生活质量和幸福指数[3,4]。OP是一种多发因素为病因的增龄性机体衰老性骨代谢疾病[5]，目前治疗OP的手段以西药为主，虽然可以在短期内达到缓解OP的作用，但是其长期治疗OP的效果以及治疗期间的不良反应仍具有不确定性。

从古到今，我国许多中医名家将骨质疏松称为“骨痹”“骨瘘”，防治骨质疏松的中药材有骨碎补、补骨脂和淫羊藿等，防治骨质疏松的经典名方有左归丸、右归丸和六味地黄丸等，这些中药材和经典名方在辨证论治的基础上应用到临床中均取得了良好的疗效[6]。怀膝颗粒中骨碎补、山茱萸、怀牛膝、川芎和鹿茸作为骨伤科常用中药，有补肾强骨的功效，常用于治疗肾虚腰痛和风湿痹痛等，其在治疗骨质疏松症方面的运用已经得到广泛认可，为临床治疗骨质疏松方剂中的常用药物[7-11]。

本研究基于怀膝颗粒中成分的复杂性和多样性，通过网络药理学，探讨怀膝颗粒治疗OP的化合物和靶点及其分子作用机制，为进一步研究怀膝颗粒治疗OP作用机制的实验及临床合理用药提供数据基础。

1 研究方法

1.1 怀膝颗粒所含化合物的收集与筛选

通过TCMSP（http://www.tcmspw.com/tcmsp.php）收集怀膝颗粒中骨碎补、山茱萸、牛膝和川芎4味药的成分，并以口服生物利用度（Oral Bioavailability,OB）≥30%和类药性（Drug Likeness,DL）≥0.18为限定条件对所收集到的化合物进行筛选。其中鹿茸未在此数据库中收录，故在中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn）中查找相关化合物，并按上述条件筛选。

1.2 怀膝颗粒所含化合物作用靶点的预测及可视化

通过TCMSP对1.1中所筛选的化合物进行靶点预测，其中鹿茸是基于化学专业数据库中化合物的CAS（Chemical Abstracts Service）号通过PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得其分子结构的，再通过Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）预测化合物作用靶点。通过uniprot数据库（https://www.uniprot.org）查询所得靶点相对应的人类基因名称，并导入Cytoscape 3.8.2软件进行可视化。

1.3 OP发病靶点检索及怀膝颗粒作用OP相关靶点的预测

将1.2所得靶点相对应的人类基因名称与通过检索TTD（Therapeutic Target Database）数据库（https://db.idrblab.net/ttd）、Genecards数据库（https://www.genecar ds.org）和OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）数据库（https://www.omim.org）所筛选出的骨质疏松症靶点进行比对，并利用Venny2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线工具绘制怀膝颗粒相关活性成分靶点和骨质疏松症靶点的韦恩图，获得其交集，即为怀膝颗粒治疗OP的作用靶点。

1.4 PPI网络构建

将上述得到的交集靶点导入String数据库（https://string-db.org/Version 11.0），选择研究物种为人类，得到蛋白互作关系网络。下载PPI（Protein Protein Interaction,PPI）蛋白网络描述文件，导入Cytoscape 3.8.2软件，用其软件自带network analysis功能进行分析得到网络节点间的拓扑学关系，从而获得靶点蛋白的相互作用关系图。

1.5 GO功能富集分析

通过Bioconductor数据库（http://www.bioconductor.org）查询交集靶点的基因ID，使用R语言通过GO（Gene Ontology）数据库对靶点的分子功能（Molecular Function,MF）、细胞组分（Cellular Component,CC）以及生物过程（Biological Process,BP）3方面进行分析并对每项排名前10的数据进行气泡图的绘制。

1.6 KEGG通路富集分析

通过R语言对交集靶点的ID进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，对排名前10的数据进行气泡图的绘制，并通过Cytoscape 3.8.2软件对KEGG富集分析中获得的关键靶点和通路联合有关化合物进行“活性成分 靶点 信号通路”网络关系构建。

2 结果

2.1 化合物的筛选

经过OB≥30%和DL≥0.18条件的筛选后，收集主要化学成分，得出骨碎补15个，山茱萸14个，牛膝17个，川芎6个，鹿茸2个，结果见表1。

2.2 作用靶点的预测及可视化

经过多种方法，共预测到主要化学成分有关的作用靶点258个，通过Cytoscape 3.8.2构建药材 活性成分 靶点网络见图1。其中绿色圆圈代表各个活性化合物，红色的三角为共有化合物，蓝色的方块代表5味药材，黄色的菱形代表相关作用靶点。

图1 药材 活性成分 靶点网络图Fig.1 Medicinal material active ingredient target network diagram

2.3 怀膝颗粒作用OP相关靶点的预测

经过TTD、Genecards、OMIM 3个数据库共检索出OP相关靶点2 271个，通过Venny2.1将成分靶点与疾病靶点取交集，得到61个共同靶点，将这61个共同靶点视为怀膝颗粒治疗骨质疏松症的潜在靶点，见图2。

图2 成分靶点与疾病靶点交集的韦恩图Fig.2 Venn diagram of the intersection of component targets and disease targets

2.4 靶点蛋白的相互作用关系分析

将怀膝颗粒与骨质疏松症交集靶点导入String数据库中，获得交集蛋白相互作用关系，去掉无连接的蛋白，再将获得的蛋白相互作用关系导入Cytoscape软件中利用其软件自带network analysis功能进行分析得到网络节点间的拓扑学关系，从而获得靶点蛋白的相互作用关系图，见图3。图中圆形节点表示单个蛋白，节点之间的连线代表2个蛋白有相互作用关系。蛋白关系网中，线越粗，颜色越深，代表两个蛋白之间的相互作用越强；节点越大，颜色越深，表明该蛋白在整个关系网中越重要。其中，雄激素受体、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6都是重要的蛋白，可能为怀膝颗粒治疗OP的核心靶点。

图3 蛋白质相互作用网络图Fig.3 Network diagram of protein interaction

2.5 富集分析结果

通过R语言对交集靶点的ID进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，筛选富集程度排名前10的结果。气泡越大，颜色越浅，则P值越小，结果越显著。如图4所示，在BP中富集显著度较高的是对类固醇激素的反应、腺体发育和对酮的反应等；在CC中富集显著度较高的是膜筏、膜微区和膜区域等；在MF中富集显著度较高的是类固醇结合、阴离子跨膜转运蛋白活性和氧化还原酶活性等。由图5可知，在KEGG中富集显著度较高的是乙型肝炎信号通路、EB病毒感染信号通路、丙型肝炎信号通路等，表明怀膝颗粒可能通过作用于这些通路起到治疗OP的作用。

图4 GO富集分析气泡图Fig.4 Bubble diagram of GO enrichment analysis

图5 KEGG富集分析气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

2.6 活性成分 核心靶点 通路网络图分析

如图6所示，对前10条通路、61个与前10条通路有关系的靶点、38个与前10条通路有关系的活性成分进行了分析，蓝色菱形代表目标靶点，黄色正方形代表通路，红色圆形代表怀膝颗粒中的活性化合物。由图可知，木犀草素（MOL000006）、槲皮素（MOL000098）、-谷甾醇（MOL000358）、豆甾醇（MOL000449）所调控的靶点较多，可能为怀膝颗粒治疗OP的主要有效成分。

图6 通路 有效成分 交集靶点网络图Fig.6 Pathway active component intersection target network diagram

3 讨论

网络药理学从整体上探索药物与疾病的相关性，具有注重药物与靶点间相互作用的特点，其整体性、系统性和与中医药学的基本特点相吻合，是一门从系统层面揭示中药对机体网络调控作用的新兴学科[12]。中药成分复杂，治疗OP的机制不明确是一个巨大的挑战，网络药理学的兴起正好解决了这个问题，将网络药理学应用于中药药理研究，在分子网络调控的背景下研究中药治疗OP的作用机制是进一步推动OP防治工作发展的主要途径[13]。肝肾亏虚与骨质疏松的发病机制有着密不可分的关系[14]。中医认为，肝主筋，肾主骨；肝藏血，肾藏精，肝肾同源而精血互生。肝肾功能正常，则骨发育正常；肝肾功能异常，则可能导致骨质疏松[15]。

怀膝颗粒由骨碎补、山茱萸、怀牛膝、川芎和鹿茸5味中药组成。该制剂对去势大鼠具有增强骨密度、增加骨钙含量的功效。怀膝颗粒治疗OP的核心有效成分为木犀草素（Luteolin）、槲皮素（Quercetin）和-谷甾醇（-sitosterol）等。尚丹等[16]研究发现木犀草素能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖；Lucía等[17]证实木犀草素能通过促进血清碱性磷酸酶（ALP）的合成进而有利于成骨细胞的分化；Kim等[18]证实木犀草素可抑制破骨细胞的分化和成熟破骨细胞的吸收活性；Yuan等[19]研究发现槲皮素通过促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨细胞的分化，改善了骨的生物力学性能，从而增加了绝经后骨质疏松大鼠的骨密度；Konar等[20]通过研究证实了槲皮素对骨形态发生蛋白2（Bone Morphogenetic Protein-2,BMP-2）的结构和构象有显著影响，表明槲皮素可作为治疗绝经后妇女骨质疏松症的潜在治疗药物；Derakhshanian等[21]通过研究发现槲皮素可以显著提高骨钙素作为骨形成标志物的作用，从而预防糖皮质激素诱导的骨质疏松症；Zhang等[22]通过实验证实了-谷甾醇可以抑制破骨细胞分化，从而治疗骨质疏松症；Chauhan S等[23]通过细胞实验发现木贼提取物对UMR-106细胞株具有明显的促成骨细胞增殖作用，这是由于其提取物中含有-谷甾醇。

在怀膝颗粒活性成分——骨质疏松对应的共同靶点蛋白质相互作用网络图中，AR、IL-6和TNF是重要的核心蛋白。其中AR在睾酮代替治疗降低男性骨质疏松症和骨折风险的过程中起着重要的作用[24]。AR通过减少骨硬化素以增强Wnt/-catenin信号通路，从而促进骨形成[25]，防止骨质疏松的发生。上调AR的调节剂对老年男性甚至女性的骨质疏松有良好的治疗作用[26]。IL-6和TNF为炎症因子，可调节氧化应激损伤，引起破骨细胞骨吸收增强，导致骨重建失衡[27,28]。IL-6作用于成骨细胞的基质细胞，通过刺激破骨细胞形成，增强破骨细胞活性，促进骨吸收，从而导致骨质疏松的形成[29]。人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）在破骨细胞前体分化为成熟的破骨细胞的过程中发挥重要作用，TNF可直接或间接促进M-CSF的产生，加速骨吸收，并使成骨细胞的凋亡加快，减慢骨合成[30]；TNF也在造成骨质疏松性疼痛中发挥了重要作用[31]。

由GO富集分析可知，在CC、BP和MF 3个方面，显著性最高的分别为膜区域、对类固醇激素的反应及类固醇结合。糖皮质激素是类固醇激素的一种，糖皮质激素会减少成骨细胞和骨细胞的寿命和活动，并减少骨骼的血管分布，从而引起骨质流失，造成骨质疏松[32]。Whittier[33]发现长期使用糖皮质激素的患者通过代替疗法后，骨密度会明显提高。

根据KEGG通路分析提示怀膝颗粒治疗OP的相关通路涉及乙型肝炎信号通路、丙型肝炎信号通路和C型凝集素受体信号通路。Chen等[34]通过抽样分析健康保险数据库的HBV患者数据，评估了乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）感染与骨质疏松症风险之间的关联，证实了HBV感染会增加患骨质疏松症的风险。Chen等[35]通过多元线性回归模型对肝脏病毒感染与骨矿物质密度（Bone Mineral Density,BMD）之间的关联进行检查，发现慢性HBV感染与男性BMD降低显着相关。Huang等[36]也通过调查发现HBV患者的BMD低于健康受试者，从而增加了患骨质疏松症的风险。丙型肝炎病毒（Hepatitis CVirus,HCV）感染是绝经后妇女骨量减少或骨质疏松的独立危险因素，预防HCV感染可能有助于降低绝经后妇女骨折风险[37]。Wijarnpreecha等[38]通过meta分析，证实了HCV感染患者患骨质疏松的机率明显高于健康人群。Olmos-Martínez等[39]通过对慢性HCV患者进行研究，发现他们的BMD和骨小梁评分（TBS）显著低于健康人群。Yue等[40]通过研究发现Clec11a是一种C型凝集素结构域蛋白，它通过促进间充质祖细胞分化为成熟的成骨细胞来防止骨质疏松。Chan等[41]通过培育敲除Clec11a基因的小鼠，发现失去Clec11a基因的小鼠在发育过程中，骨骼体积仅为正常小鼠的一半，且形成骨小梁的能力大大降低。

综上所述，怀膝颗粒治疗OP具有多靶点、多途径和多通路的特点，也体现了中医学的辨证论治与整体观念，基于网络药理学分析药物与疾病的相互关系能有效的揭示怀膝颗粒治疗OP的可能机制。结果表明，怀膝颗粒中的活性成分木犀草素、槲皮素和-谷甾醇等可能通过作用于AR、IL-6和TNF等关键靶点，在膜区域上抑制类固醇结合并调控乙型肝炎信号通路、丙型肝炎信号通路和C型凝集素受体信号通路等发挥其临床功效，达到治疗OP的目的。由于本研究主要基于数据库信息的提取，虽然使用多个数据库进行综合分析，但仍可能与怀膝颗粒发挥作用的实际过程存在一定的区别，下一步需要通过动物模型实验和细胞生物学实验进行验证。