淫羊藿骨碎补鹿骨片对低钙饮食所致骨质疏松幼年大鼠的影响

王玉，赵宏宇，刘新宇，邸琳

（吉林省中医药科学院，吉林 长春 130012）

儿童缺钙导致生长发育迟缓，使其整体体格发育异常，导致身材矮小、佝偻病等疾病的发生[1]，所以对于缺钙的儿童应该尽早地预防和治疗由于缺钙导致的生长发育迟缓[2]。中药防治骨质疏松症是临床医学中的一个治疗手段[3-5]，在治疗骨质疏松方面有独特的疗效。中药能改变骨组织结构和增加骨密度等[6]，但作用机理尚不清楚，并且中药对于小儿缺钙的防治研究和药物开发也较缺少。

在中医理论中，淫羊藿中有效成分是淫羊藿苷，通过补肝肾、强筋骨而达到治疗目的，以其补肾阳、益肾精之功而为君药[7-9]。骨碎补有增加骨密度和骨强度的作用，能促进骨细胞骨形态形成[10,11]。鹿骨主治虚劳骨弱、风湿痹痛等，具有补虚羸和强筋骨等功效[12]。采用刚出生1个月左右的断乳大鼠，给予低钙饲料，淫羊藿骨碎补鹿骨片为受试物，通过测定身长、体重、血清标志物、骨密度以及股骨病理等指标研究受试物对低钙幼鼠的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

取60只出生4周左右的断乳SD大鼠，体重60～80 g，雌性，购自于辽宁长生生物技术股份有限公司，生产许可证号为SCXK-（辽）2020-0001；由吉林省中医药科学院实验动物伦理委员会审核通过，符合实验动物伦理委员会规定。

1.2 受试物及饲料

淫羊藿骨碎补鹿骨片主要成分为淫羊藿提取物、骨碎补提取物、鹿骨粉和碳酸钙等，吉林省中医药科学院自制；低钙饲料购自北京科澳协力饲料有限责任公司。

1.3 仪器及材料

Faxitron双能X射线小动物骨密度仪（仪器型号：Faxitron-UltraFocus,VIS-10 15，美国Faxitron）；Direct-Pure System超纯水系统，购自Rephile Bioscierce,Ltd（上海乐枫生物科技有限公司）；BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；JA2003B型千分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）；大鼠秤（型号：YP10001，上海佑科仪器仪表有限公司生产）；PINP、BALP ELISA试剂盒（上海泛柯实业有限公司生产，批号：202001）；无机磷检测试剂盒（试剂批号：2020122301；校准品批号：2020120801）；钙检测试剂盒（试剂批号：2020122801；校准品批号：2020122801）。

2 试验方法

2.1 动物分组及给药

60只断乳雌性大鼠正常饲料适应3 d后，禁食16 h，称体重，按体重随机分为低钙组、高钙组（碳酸钙333 mg/kg）、淫羊藿骨碎补鹿骨片高剂量组[1.7g/（kg bw），含碳酸钙（333 mg）]、中剂量组[0.85 g/（kg bw），含碳酸钙（166 mg）]、低剂量组[0.425 g/（kg bw），含碳酸钙（84mg）]，单只分笼饲养，连续灌胃4周。低钙组、高钙量组与淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中和低剂量组以基础低钙饲料喂养，全部自由饮超纯水，以避免从饮水中获得钙。灌胃给予受试物，每日1次，体积10 mL/（kg bw）。

2.2 指标测定

2.2.1 大鼠体重、身长、食量和食物利用率的测定 每周称体重1次（g），测量身长1次（嘴尖到肛门距离cm），每周称饲料1次，计算食物利用率（每周增长体重/每周食量乘以100%），连续4周。

2.2.2 大鼠骨代谢标志物及血钙、血磷测定 末次给受试物后24 h处理。试验结束，腹主动脉采血，3 000 r/min离心10 min，取血清，用酶联法测定血清中骨代谢标志物：Ⅰ型原胶原N端前肽（PINP）、骨碱性磷酸酶（BALP）。取血清测定血钙、血磷浓度，用偶氮胂Ⅲ法测定血钙浓度，用磷钼酸盐法测定血磷浓度。

2.2.3 大鼠股骨重量、骨密度和钙含量测定 取双侧股骨，左侧股骨用于骨密度测定（整根股骨的平均骨密度，采用Faxitron双能X射线小动物骨密度仪直接测定）和骨钙测定[取其中左侧股骨，于105℃烤箱中烤至恒重，称量骨干重，然后置于马弗炉中灰化，灰化完成后加硝酸水溶液（1+1）消化，定容，用EDTA滴定]。

2.2.4 大鼠骨病理检查 右侧股骨用于骨组织病理学检查。

3 实验结果

3.1 大鼠体重、身长、试食量及食物利用率的影响

淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组及高钙组大鼠体重、身长、食量和食物利用率[13]与低钙组比较，差别无显著意义（P＞0.05），结果见表1。

表1 受试物对食用低钙饲料大鼠体重、身长、食量及食物利用率的影响Table 1 Effects of the experiment on the body weight,body length,food intake and food utilization in rats fed with the low calcium diet

3.2 大鼠BALP、PINP及血钙、血磷的影响

淫羊藿骨碎补鹿骨片高剂量组与低钙组比较，大鼠血清PINP含量显著增加，具有极显著差异（P＜0.01），中剂量组和高钙组与低钙组比较，差异显著（P＜0.05）。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组与低钙组比较，大鼠血清BALP活性显著增加，具有极显著差异（P＜0.01），高钙组大鼠血清BALP活性有增加趋势，但与低钙组比较两组差别不显著（P＞0.05）。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组和高钙组大鼠与低钙组比较，血钙含量显著增加，差异显著（P＜0.05）。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组和高钙组大鼠与低钙组比较，血磷含量差异不显著（P＞0.05），结果见表2。

表2 受试物对饲喂低钙饲料大鼠BALP、PINP及血钙和血磷的影响Table 2 Effects of the test substance on BALP,PINP,blood calcium and blood phosphorus in rats fed with the low calcium diet

3.3 药物对大鼠股骨重量、骨密度和钙含量的影响

淫羊藿骨碎补鹿骨片高剂量组及高钙组大鼠股骨骨密度与低钙组比较，显著增加，有极显著差别（P＜0.01），中剂量组大鼠股骨骨密度与低钙组比较，显著增加，有显著差别（P＜0.05）。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组及高钙组大鼠股骨重量与低钙组比较，显著增加，有极显著差别（P＜0.01）。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组及高钙组大鼠骨钙含量与低钙组比较，显著增加，有极显著差别（P＜0.01），结果见表3。

表3 受试物对饲喂低钙饲料大鼠骨密度、股骨重量、骨钙的影响Table 3 Effects of the test substance on the bone mineral density,femur weight and bone calcium of rats fed with the low calcium diet

图1为大鼠左侧股骨双能X射线扫描骨密度图，每5只一张图片。

图1 大鼠左侧股骨双能X射线扫描骨密度图Fig.1 The bone density of rat left femur by the dual-energy X-ray scanning

3.4 大鼠骨病理检查结果

图2为股骨病理图片。低钙组饲喟后大鼠股骨骨皮质变薄，骨皮质内破骨细胞增多；骨小梁变细，骨小梁间距增加，骨小梁分布疏松。骨组织内未见炎症反应，未见软骨退变。

图2 对大鼠股骨病理学影响Fig.2 Effects on the pathology of the rat femur

高钙组和淫羊藿骨碎补鹿骨片高剂量组、中剂量组和低剂量组与低钙组比较，高钙组动物股骨骨皮质明显增厚，骨皮质内少见破骨细胞；骨小梁增粗，骨小梁间距缩小，骨小梁分布数量增加。骨组织内未见炎症反应，未见软骨退变。其中高剂量组动物股骨骨皮质增厚程度增加，动物骨形态评分明显改善。

依据评分标准，对股骨染色结果进行评分，统计结果见表4。

表4 大鼠股骨组织常规染色观察结果统计Table 4 Statistical observation of routine staining of the rat femur tissue

4 讨论与结论

幼儿是骨形成的重要阶段，幼儿缺钙对儿童骨骼生长发育造成严重的危害[14]。有研究表明，在儿童和青少年时期增加骨量峰值，可以降低老年罹患骨质疏松的发病率[15]。

本研究中食用低钙组饲料的幼龄大鼠的身长、体重、食量和食物利用率与其他组比较均没有显著性差别，但是通过骨扫描和病理学检查，骨密度和骨组织结构与高钙组和淫羊藿骨碎补鹿骨片组比较，均低于高钙组和给药组。股骨重量和骨钙含量低钙组也明显低于高钙组和给药组。

BALP与PINP都是骨形成标志物[16]。PINP是I型原胶原N端前肽，是监测骨代谢微小变化最敏感的指标[17]，用于监测骨形成的标志物，PINP与成骨细胞的活跃程度呈线性相关，主要反映I型胶原蛋白的合成速率和骨转换情况，由于低钙组大鼠食用低钙饲料，所以骨骼成长矿化受阻，I型胶原蛋白的合成速率和骨转换要低于高钙组[18-20]，所以血清中PINP与高钙组比较，低于高钙组。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中剂量组血清中PINP高于低钙组，说明淫羊藿骨碎补鹿骨片的高、中剂量起到了与高钙组相似的效果，得出显著性结果。BALP是骨特异性碱性磷酸酶，是成骨细胞的一种细胞外酶，利于骨形成，合成于骨基质成熟阶段，与骨的正常生长发育密切相关[21,22]。由于低钙组食用低钙饲料，合成骨基质少于高钙组，所以高钙组血清中BALP高于低钙组血清中BALP。淫羊藿骨碎补鹿骨片高、中、低剂量组血清中BALP高于低钙组。

血磷、血钙是骨密度检查时常规检测的指标[23,24]，低钙组大鼠由于缺乏钙的摄入和补充，造成低血钙，高钙组和给药组的各剂量组血钙都在正常水平。血磷的含量在血液中是比较稳定的，低钙并没有造成血磷含量波动，各组之间并没有显著性差异。

综上所述，淫羊藿骨碎补鹿骨片具有提高低钙饮食所致骨质疏松幼年大鼠骨密度和骨钙的功效。