‘申鸿七彩雉鸡’mtDNA全基因组序列测序和系统发育关系分析

陈芳，覃健峰，郑德滨，袁红艳，吴琼※

（1.龙岩学院生命科学学院，福建 龙岩 364012；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海 201400）

雉鸡，学名环颈雉，俗称野鸡、山鸡。在动物分类学属于鸟纲（Aves）鸡形目（Gallinales）雉科（Phasianidae）雉属（Phasianus）。雉鸡在我国饲养较早，3 000年前殷商甲骨文中记载有“雉”字。《本草纲目》详细记载了雉鸡各部位的药用价值[1,2]。在野生状态下，雉鸡分为30个亚种，其中在我国境内分布有19个亚种，除西藏和海南外，全国各地均有分布。我国对雉鸡大规模驯养和研究始于20世纪60年代，1981年获得成功，自此雉鸡人工养殖技术在全国范围内进行了大规模的推广普及。我国雉鸡饲养业历经30多年的发展，从无到有，从小到大，得到了飞速的发展[3]。

‘申鸿七彩雉鸡’（Shenhong pheasant）是2011年由上海欣灏珍禽育种有限公司联合中国农业科学院特产研究所等4家单位历经7年联合选育的肉蛋兼有型雉鸡新品种，2019年通过国家畜禽遗传资源委员会审定。‘申鸿七彩雉鸡’18周龄上市体重公雉达1 350 g、母雉鸡达1 000 g，饲养56周龄日产蛋130个。与其他雉鸡品种相比，生长速度快、肉用性能好且产蛋多，中试结果体现了较强的适应性，具有先进的综合生产性能，符合市场需求，具有广阔的推广前景。

线粒体基因组结构简单，编码基因内不含内含子，能够独立地进行复制和转录，世代间无基因重组。线粒体严格遵循母系单性遗传的特性，单一的一个样本就能够携带群体的全部基因，代表一个母系群体特征，通过少量的样本就能够对群体的遗传结构进行全面分析，而且结果可靠，有利于群体遗传研究[4,5]。‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体全基因组序列目前还未见报道，本研究利用PCR测序方法，获得‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组全长序列，并与其他雉鸡序列构建系统进化树，为‘申鸿七彩雉鸡’种质资源的保护和利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

样本来自上海欣灏珍禽育种有限公司3层笼养的‘申鸿七彩雉鸡’3个个体。翅静脉采血，EDTA抗凝，充分混匀保存于﹣20℃冰箱备用。

1.2 血液DNA提取和鉴定

参照南京诺维赞生物科技股份有限公司的全血基因组DNA快速提取试剂盒（柱式），具体步骤见说明书。利用琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中观察电泳结果，DNA条带为单一致密的样品可作为后续试验材料，说明DNA质量较好且无降解。利用分光光度法检测DNA浓度，样品的OD260nm/OD280nm比值在1.6～1.8之间，则表明DNA纯度较高。检测合格后放置﹣20℃冰箱备用。

1.3 引物设计

根据线粒体DNA环状双链闭合的结构特点，参照NCBI中已公布的雉鸡线粒体基因组全序列（登录号：FJ752430），Primer Premier 5.0和Oligo 6.0设计覆盖雉鸡线粒体全序列的引物，见表1，由上海生物工程有限公司合成。新合成引物需低速离心后，按照引物合成单上的说明，用灭菌双蒸水稀释到20 m，室温溶解3 h以上，然后﹣20℃保存。

表1 扩增片段的PCR引物Table1 Primers for PCR

1.4 PCR扩增及测序

根据提取的DNA模板长度进行PCR，对反应体系进行优化配置，并通过梯度PCR摸索合适的退火温度及反应条件。PCR反应体系为25L：2 Es Taq MasterMix 15L、上下游引物各0.5L，DNA模板1.0L，dd H2O 11.5L。PCR反应条件为：预变性94℃，5 min，变性94℃，30s，退火以实际摸索的温度，30s，延伸72℃，60 s，再延伸72℃，5 min，循环数为35次。PCR产物在1%琼脂糖凝胶（含核酸染料）上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照保存。选取符合条件的PCR产物送往上海生物工程股份有限公司测序。

1.5 数据分析

1.5.1 使用Geneious软件进行雉鸡线粒体全基因组序列注释分析。

1.5.2 构建进化树，建进化树之前，使用Dambe 5进行碱基替换饱和性分析，在核苷酸序列显示未饱和的前提下，方可建树[6]。使用jModelTest 2.1.7[7]计算似然值，基于BIC标准对数据进行模型选择[8]，线粒体13个蛋白质编码基因的最优模型为HKY+I+G。使用Mega 7.0软件采用最大似然法（Maximum Likelihood method,ML）构建系统进化树，自举检验参数设置为1 000次。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取、PCR扩增及测序结果

图1 基因组DNA电泳图Fig.1 Electrophoretic analysis of genomic DNA

2.2‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组的序列分析

组装注释得到‘申鸿七彩雉鸡’3个样品的全线粒体基因组，3个样品的线粒体基因组完全相同，全长为16 685 bp。结构均为典型的环状双链，包括13个蛋白质编码基因（ND1、ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5、CYTB和ND6）、2个rRNA（12S rRNA和16S rRNA）、22个tRNA和一个非编码的控制区（D-Loop）。

‘申鸿七彩雉鸡’13个蛋白编码基因总长度平均为11 369 bp，占整个基因组的68.13%，其中ND6由L链编码，其余均由H链编码。‘申鸿七彩雉鸡’最长的蛋白质编码基因是ND5，为1 818 bp，最短的是ATP8基因，为165 bp。13个蛋白质编码基因中，密码子规律同中国环颈雉。基因重叠有7处，总长度为30 bp；基因间隔为20处，总长度为52 bp；基因间无间隔和重叠有11处。

表2 ‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组基因定位和特征表Table 2 Gene locations of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

续表2

2.3 rRNA和D-loop序列控制区

‘申鸿七彩雉鸡’12S rRNA和16S rRNA长度分别为966 bp和1 619 bp，占整个基因组的5.79%和9.70%。两个rRNA位于tRNA-Phe和tRNA-Leu（UUR）之间，被tRNA-Val基因分隔开。D-loop序列控制区位于tRNA-Phe和tRNA-Glu之间，序列长为1 148 bp，占整个基因组的6.88%。

2.4 tRNA

tRNA基因共有22个，长度为65～78 nt，tRNA全长为1 541 bp，占整个基因组的9.24%。tRNA基因中最长为tRNA-Trp，最短为tRNA-Ser（AGY）。tRNA均可以折叠形成三叶草结构。

2.5‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组碱基组成特征

‘申鸿七彩雉鸡’线粒体全基因组、蛋白质编码基因、tRNA、rRNA和D-Loop区碱基组成见表3。所有基因AT含量均大于CG含量，D-Loop区的AT含量最高，为60.02%，其次是含量为58.73%的tRNA，最低为PCG，含量55.33%。

表3 ‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组碱基组成Table 3 Base composition of mitochondrial genome of'Shenhong pheasant'

2.6‘申鸿七彩雉鸡’与其他雉鸡进化关系

选择NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）发布的7条雉鸡线粒体全基因组序列，包括日本绿雉2条、环颈雉4条和甘肃亚种雉鸡1条，与本研究的‘申鸿七彩雉鸡’均提取13个蛋白质编码基因序列。构建的系统发育树显示，10个雉鸡种群分为两支，‘申鸿七彩雉鸡’和‘甘肃亚种雉鸡’聚在一起。日本绿雉和环颈雉聚在一起（图2和图3）。

图2 基于蛋白质编码基因的‘申鸿七彩雉鸡’与雉鸡进化树（ML）Fig.2 Electrophoretic analysis of genomic DNA

图3 基于蛋白质编码基因的‘申鸿七彩雉鸡’与雉鸡进化树（NJ）Fig.3 Electrophoretic analysis of genomic DNA

3 讨论

3.1 ‘申鸿七彩雉鸡’线粒体基因组的大小和密码子使用

‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体基因组与其他鸟类动物相似，为环状双链DNA分子。线粒体蛋白质编码基因的密码子使用，作为起始密码子，线粒体13个蛋白质编码基因中9个基因使用ATG，ATG是动物最常用的起始密码子，2个基因使用ATA，NAD5基因使用ATA。在鸟类动物中，NAD4L基因都使用GTG作为起始密码子，GTG是真核生物线粒体基因组中特有的起始密码子。作为终止密码子，大多基因使用完整终止密码子TAA、TAG和AGA，少数使用不完整终止密码子T。李喜凤[9]分析了环颈雉线粒体基因组全序列，全长为16 692 bp，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和一个非编码控制区；环颈雉的控制区长度为1 147 bp，可分为3个区：domain I～III；本研究中‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体基因组结构、碱基组成和基因排列顺序均与鸡形目其他物种相似。

3.2 基于线粒体编码蛋白基因‘申鸿七彩雉鸡’分子系统进化关系

吴琼等[10]关于线粒体细胞色素b基因序列的研究显示，日本绿雉单成一个系，‘中国环颈雉’‘蒙古雉鸡’‘黑化雉鸡’‘申鸿七彩雉鸡’混在一支。‘申鸿七彩雉鸡’是我国野生雉鸡驯化后的中国山鸡与上海本地饲养的山鸡杂交形成的品种，上海本地山鸡为90年代初我国从美国引进的中国环颈雉，长期饲养适应本地条件而形成的雉鸡种群。刘影[11]关于线粒体基因组全序列的研究显示，‘美国七彩山鸡’（中国环颈雉）来源于野生雉鸡亚种，这与本研究中‘申鸿七彩雉鸡’与‘甘肃亚种雉鸡’互为姐妹群相一致。

4 结论

‘申鸿七彩雉鸡’的线粒体DNA基因组全长为16 685 bp，为典型的环状双链DNA分子，其线粒体基因组结构、碱基组成和基因排列顺序均与鸡形目其他物种相似。‘申鸿七彩雉鸡’与‘甘肃亚种雉鸡’互为姐妹群。