(+)-4-萜品醇对蜡样芽孢杆菌混菌生物膜的清除及与微酸性电解水协同作用研究

田雪，赵丽君，莫晓慧，段飞霞,2*

(1.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065；2.食品科学与技术四川省高校重点实验室，成都 610065)

细菌生物膜是菌体细胞聚集、附着在固体表面或气液界面而形成的生物活性基质[1]；对盐浓度、干燥、高温、抗生素、灭菌剂和食品防腐剂具有高度的耐受性[2]。食源性病原菌蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)极易污染米饭、乳品、豆制品、果蔬表面及禽畜产品，在各类食品中均有检出，某些亚群可产生耐高温呕吐毒素[3]，引发严重的食物中毒和食品腐败[4-6]。蜡样芽孢杆菌易形成高抗性、难清除的生物膜，是导致加工中反复交叉污染和加工后污染的主要原因[7-8]。现有研究表明，含氯消毒剂，如次氯酸钠、季铵盐等，与高压水清洗联用，尚不能有效清除蜡样芽孢杆菌生物膜，且易损伤食品原料，产生消毒剂残留，增加微生物耐药风险，亟待研究新的菌膜清除策略[9]。

微酸性电解水(SAEW)，是刺激性相对较低的含氯消毒剂，用于食品及医药工业[10-11]。植物香料天然精油是抗菌和抗细菌生物被膜的潜在资源[12]。(+)-4-萜品醇为含氧单环单萜化合物，呈清淡的木香味，是罗勒、牛至、香叶等香料及茶树精油的重要组分[13]。含(+)-4-萜品醇植物精油多具有抑菌活性，但(+)-4-萜品醇单体化合物的抑菌和清除细菌生物膜作用尚不明确[14]。

本文采用结晶紫法等研究了(+)-4-萜品醇对蜡样芽孢杆菌等多种食源性病原菌的抑菌作用和生物膜清除能力，探究其与SAEW的协同作用；采用场发射扫描电镜(FESEM)，观察(+)-4-萜品醇和SAEW对常见食品加工接触表面蜡样芽孢杆菌混菌生物膜的清除及对微观结构的影响，为探索安全、高效、低残留的混菌生物膜清除方法提供了理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

肉汤培养基、胰蛋白大豆肉汤培养基；聚氨酯板(PU)：规格10 mm×10 mm；聚氯乙烯(PVC)：规格10 mm×10 mm；(+)-4-萜品醇：CAS号2438-10-0；SAEW：有效氯浓度高于120 μg/mL。

1.2 菌种

蜡样芽孢杆菌(BacilluscereusATCC 14579)、鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellatyphimuriumATCC 14028)、大肠杆菌(EscherichiacoliATCC 25922)、铜绿假单胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、阪崎克罗诺杆菌(CronobactersakazakiiATCC 29544)、金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538)：购自ATCC美国典型生物资源保藏中心。

1.3 菌种培养

LB肉汤、胰蛋白大豆肉汤培养基于121 ℃灭菌15 min备用；蜡样芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌接种后于37 ℃恒温培养至对数生长期。

1.4 最低抑菌浓度测定

按照冯林慧等[15]的方法测定不同浓度(+)-4-萜品醇、SAEW及二者联用时不同细菌的生长情况。吸取对数生长期不同菌液，用无菌TSB接种于96孔板中，接种浓度按麦氏比浊度0.05计，分别加入0～128 μmol/mL (+)-4-萜品醇、0～96 μg/mL SAEW，37 ℃恒温培养24 h，采用酶标仪在600 nm处测定各孔吸光度值[16]。对照及每个浓度组均设置3组平行，重复3次实验[17]。

1.5 生物膜的清除

按照柴旭锋等[18]的方法清除已形成的生物膜。聚氨酯、聚氯乙烯小块灭菌后，用95%乙醇淋洗3～5次待用。吸取对数生长期菌液分别接种于96孔板和6孔板中，接种浓度按麦氏比浊度0.05计，6孔板中放入聚氨酯、聚氯乙烯小块，96孔板置于37 ℃恒温培养48 h，6孔板培养72 h后，各孔加入不同浓度的(+)-4-萜品醇、SAEW和采用SAEW溶解的(+)-4-萜品醇溶液，暗室静置30 min。96孔板中各孔轻轻吸去自由漂浮的细胞及培养液，用无菌PBS缓冲液清洗2次，使其风干待测。取出6孔板中聚氨酯、聚氯乙烯小块，待测。

1.6 结晶紫法测定菌膜残留量

按照张君怡等[19]的方法测定菌膜残留量。向每孔中加入200 μL甲醇固定15 min，倒扣倾出甲醇，风干后每孔加入200 μL 0.10%的结晶紫染色液，染色15 min，用无菌PBS缓冲液洗涤3次并风干；每孔加入200 μL 33% 冰乙酸，静置5～15 min。使用酶标仪测定570 nm处的吸光度[20]。对照及每个浓度组均设置3组平行，重复3次实验。

1.7 FESEM观察

将1.5中聚氨酯、聚氯乙烯小块置于2.5%戊二醛的溶液中，在4 ℃下固定15 h，用无菌水洗涤、晾干，用乙醇溶液(10%、30%、50%、70%、90%和95%)梯度脱水处理，各梯度脱水15 min后风干。样品置于高真空蒸发器中，喷金镀膜，用场发射扫描电镜观察细菌生物膜的形态结构。

1.8 统计与数据分析

所有实验重复测定3次，取平均值进行数据分析，标准差在各图中用误差线表示。采用Origin 8.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 (+)-4-萜品醇抑菌作用

不同浓度(+)-4-萜品醇作用下，常见食源性病原菌革兰氏阳性(G+)菌蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性(G-)菌大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长情况见图1。

图1 (+)-4-萜品醇作用下蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌的生长情况Fig.1 The growth situations of B. cereus, S. aureus, E. coli, C. sakazakii, S. typhimurium and P. aeruginosa in the presence of (+)-4-terpineol

由图1可知，(+)-4-萜品醇对G+菌和G-菌都具有显著的抑菌作用，对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌生长的抑制作用显著，其最低抑菌浓度(MIC)为8 μmol/L；对鼠伤寒沙门氏菌生长的抑菌浓度最好，其MIC为2 μmol/L，对铜绿假单胞菌的MIC为128 μmol/L。

2.2 (+)-4-萜品醇与SAEW的协同抑菌作用

2.2.1 对纯培养食源性病原菌的协同抑菌作用

(+)-4-萜品醇与SAEW对6种纯培养食源性病原菌的生长抑制的协同作用见图2。

由图2可知，0～96 μg/mL的SAEW对细菌生长的抑制作用随着处理浓度的增加而逐渐增强。96 μg/mL的SAEW对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌生长的抑制率分别为36%、48%、35%、30%、37%和40%。

采用4 μmol/mL(1/2 MIC)(+)-4-萜品醇与SAEW同时处理时，96 μg/mL的SAEW对上述细菌生长的抑制率提高到85%、84%、59%、56%、90%和42%；其中，对蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的协同抑菌效果最佳。6 μmol/mL的(+)-4-萜品醇单独作用，可完全抑制大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的生长，与12 μg/mL的SAEW协同作用即可完全抑制金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和阪崎肠杆菌的生长。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇完全抑制了铜绿假单胞菌以外的其他5种食源性病原菌，与SAEW同时处理对铜绿假单胞菌生长的抑制作用也不显著，可能与(+)-4-萜品醇自身的抑菌作用特点有关。

上述实验结果表明，SAEW在0～96 μg/mL的浓度范围内不能完全抑制蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌单一菌种培养物的生长；(+)-4-萜品醇与SAEW存在协同抑菌作用，对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌生长的协同抑制作用最为显著。

2.2.2 对混菌生长的协同抑制作用

(+)-4-萜品醇与SAEW对蜡样芽孢杆菌混菌生长抑制的协同作用见图3。

由图3可知，单独使用微酸性电解水作用于混菌时，随着SAEW浓度的增大，混菌的生长受到一定程度的抑制，96 μg/mL的SAEW对蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌及6种菌混合培养物生长的抑制率分别为32%、36%、34%、29%、25%和36%，略低于对单一培养物的抑制率。

采用6 mmol/L的(+)-4-萜品醇与不同浓度SAEW同时处理，达到上述程度抑制率所需SAEW的浓度下降为12，24，12，36，0，24 μg/mL；完全抑制蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌及6种混菌培养物的生长所需SAEW浓度分别为96，84，96，24，96 μg/mL。(+)-4-萜品醇的浓度为8 μg/mL时，可完全抑制蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及6种菌混合培养物的生长，与12 μg/mL的SAEW同时处理能够完全抑制蜡样芽孢杆菌与阪崎肠杆菌混菌的生长。

上述实验结果表明，0～96 μg/mL的SAEW不能完全抑制蜡样芽孢杆菌混菌的生长；(+)-4-萜品醇与SAEW对蜡样芽孢杆菌混菌的生长同样具有协同抑制作用，但作用浓度略高于单一培养物，对蜡样芽孢杆菌与鼠伤寒沙门氏菌混菌生长的抑制作用最为显著。

2.3 (+)-4-萜品醇对细菌生物膜的清除作用

(+)-4-萜品醇、SAEW对96孔板中培养48 h后的各类细菌生物被膜的清除作用见图4中A和B。(+)-4-萜品醇在8～16 μmol/mL浓度下，对蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的清除作用随着浓度的增加而增强；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇对上述单一菌种菌膜的清除率分别为：蜡样芽孢杆菌21%、51%；大肠杆菌77%、81%；铜绿假单胞菌37%、48%；阪崎肠杆菌26%、57%；金黄色葡萄球菌40%、65%；鼠伤寒沙门氏菌51%、53%；最大清除率可达到80%以上(见图4中A)。

SAEW对96孔板中培养48 h后的蜡样芽孢杆菌生物膜没有明显清除作用；但可一定程度上清除大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌的单一菌种生物膜，其清除率呈现出随处理浓度先增大后减小的趋势，在30 μg/mL具有最大清除率69%。

(+)-4-萜品醇与SAEW的协同作用见图4中C和D。(+)-4-萜品醇与30 μg/mL的SAEW共同作用对单一菌种菌膜具有明显的菌膜清除能力，其清除率约为38%～73%，低于(+)-4-萜品醇单独作用；8 μmol/mL和16 μmol/mL的(+)-4-萜品醇在生物膜清除率上无显著差异。(+)-4-萜品醇与SAEW协同清除蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混菌生物被膜的作用见图4中D，其清除率在SAEW浓度为30 μg/mL和(+)-4-萜品醇浓度为16 μmol/mL时达到最大62%；16 μmol/mL(+)-4-萜品醇的协同清除效果略高于8 μmol/mL。

上述实验结果显示：(+)-4-萜品醇处理30 min对已形成的蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌生物膜具有显著清除作用，其清除率随着浓度的增加而增大；而SAEW对蜡样芽孢杆菌生物膜的清除作用不明显，对其他5种生物膜的清除作用在30 μg/mL最强；(+)-4-萜品醇的清除效果优于SAEW。(+)-4-萜品醇与SAEW共同处理已形成的生物膜，其清除率高于SAEW单独作用。

2.4 FESEM微观结构观察

PU、PVC是食品加工中常见传送材料和典型食品接触面。采用FESEM观察蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混合生物膜在PU、PVC上的黏附情况，及(+)-4-萜品醇、SAEW处理菌膜微观结构的变化，见图5。

图5 (+)-4-萜品醇与微酸性电解水对PVC和PU表面蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混菌生物膜微观结构的影响Fig.5 Effects of (+)-4-terpineol and SAEW on the microstructures of the mixed biofilms of B.cereus and S.typhimurium on the surfaces of PVC (A) and PU (B)

对照组见图5中A(i)、B(i)，24 h培养后，蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌在PVC、PU材料上形成了致密的混菌生物膜，可观察到胞外基质包裹的长短不一的杆状菌体细胞；PVC材料表面的生物膜中，菌体呈交叠状排列，生物膜表面能观察到无规、均匀排布的空隙。

30 μg/mL SAEW对PU和PVC表面的蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混菌生物膜有明显的清除效果，但可观察到材料上残余的生物膜表面形成了极致密的薄膜状物质包裹住大量菌体(见图5中A(iii)、B(iii))，这一现象可能与2.3中观察到SAEW菌膜清除率随浓度先增大后减小的结果(见图4中B)有关。8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇处理PU和PVC表面菌膜30 min后，PU和PVC表面的生物膜被大量清除，可观察到少量稀疏的菌体聚集物黏附在表面，其清除效果优于30 μg/mL的SAEW，见图5中A(ii)、B(ii)。

(+)-4-萜品醇(8 μmol/mL)与SAEW(30 μg/mL)的联合清除作用见图5中A(iv)、B(iv)。尽管(+)-4-萜品醇与SAEW联用对蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混菌生物膜仍有明显清除作用，其清除效果略优于SAEW单独作用，但不如(+)-4-萜品醇单独处理组。推测SAEW处理时导致了未脱落细菌胞外基质的致密化(见图5中A(iii))，阻碍了(+)-4-萜品醇向生物膜内部的进一步渗透，细菌黏附作用增强，在一定程度上阻碍了生物膜的清除效果。

上述实验结果显示：8 μmol/mL的(+)-4-萜品醇与30 μg/mL的SAEW处理3 min，均能有效减少PU和PVC表面的蜡样芽孢杆菌/鼠伤寒沙门氏菌混菌生物膜，但尚不能达到完全清除作用，在实际应用中，可考虑与高压水形成的机械剪切力共同作用，进一步提高清除效果。(+)-4-萜品醇单独处理组的效果优于SAEW处理组，由于SAEW处理可能导致胞外基质致密化形成渗透阻碍，二者的协同效果不明显。

3 结论

通过对(+)-4-萜品醇对蜡样芽孢杆菌等食源性病原菌的抑菌活性、生物膜清除能力、菌膜微观结构及与SAEW协同作用的研究，证实(+)-4-萜品醇单体具有广谱抑菌作用，其最低抑菌浓度为2 μmol/mL，与SAEW具有协同抑菌作用；(+)-4-萜品醇能够快速清除蜡样芽孢杆菌及各类细菌生物膜，清除率可达80%以上，清除效果显著优于SAEW。(+)-4-萜品醇有望成为安全、高效的广谱抗菌剂和细菌生物膜清除剂，应用于食品加工领域。