牛奶中氯霉素残留检测及四种前处理方法效果的比较

马 辉，温 花，赵绪永，李国庆

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450046)

氯霉素是一种广谱的抑菌型抗生素，其药性稳定，治疗及预防作用显著[1,2]，但其会在动物体内残留[3]，残留的氯霉素可能抑制人体的造血功能，减少血细胞的数量，引起再生障碍性贫血[4,5]。

氯霉素检测通常采用酶联免疫吸附反应(ELISA)、高效液相色谱(HPLC)和气-质联用(GC-MS)等方法。酶联免疫法检测氯霉素残留量较为方便，并且可简化预处理过程[6]。胶体金免疫层析法不需要检测设备，无需提前准备，成本低，操作快，适合少量样品的抗生素含量检测[7]。在氯霉素残留检测过程时，甲醇、乙醇及乙酸乙酯等常用作氯霉素的提取剂，乙醚、石油醚和苯等则不常用，因为氯霉素在乙醚、石油醚和苯等试剂中不易溶解。氯霉素在干燥环境下较稳定，但受热易降解[8]。在弱酸或中性溶液中性质比较稳定，在碱性溶液中极不稳定，易于分解。氯霉素的取代苯环与蛋白质载体发生反应，使得氯霉素的紫外吸收增强[9]。

本试验用胶体金免疫层析法检测六种市售牛奶样品的氯霉素残留量，比较四种不同前处理方法对检测效果的影响，为牛奶中氯霉素的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

巴氏杀菌鲜牛奶、风味牛奶(复原乳)、红枣牛奶等三种奶制品均购自河南牧业经济学院教育超市；伊利品牌盒装牛奶购自网上超市；两种生牛乳购自某牛场。

1.2 试验仪器

FA2104A电子天平(上海精天电子仪器有限公司)；MK-3酶标仪(赛默飞世尔有限公司)；MIX-25P涡旋器(杭州米欧仪器有限公司)；RE-52旋蒸仪(上海亚荣生化仪器公司)；H1650离心机(湖南湘仪有限公司)。

1.3 试剂

氯霉素酶联免疫试剂盒和氯霉素快速检测卡(北京勤邦有限公司)；乙酸乙酯(华天生物科技有限公司)；氯化钠、亚铁氰化钾、硫酸锌、正己烷、甲醇均为国产分析纯(天津恒兴化学制剂有限公司)；氢氧化钠为国产分析纯(郑州派尼化学试剂厂)。

1.4 标准曲线的建立

1.4.1 酶联免疫吸附试验

氯霉素酶联免疫检测试剂盒4 ℃冷藏，使用时从冰箱拿出，恢复至室温。在微孔板的微孔中加入50 μL不同浓度(0.025、0.075、0.3、1.2、4.8 ppb)的氯霉素标准溶液，再各加入50 μL氯霉素单抗-HRP结合物。用薄板将微孔板盖住，在阴处或避光处静置30 min。待反应完毕后将微孔内的液体倒出，加入提前配制好的PBST洗涤液250 μL，轻微震动或拍打微孔板四周，随后倒出，用专用吸水纸吸取孔板四周多余水分，洗涤5～6次，每次间隔20 s。加入底物液TMB和H2O2各50 μL，轻微敲打微孔板四周，并略振荡，以防孔内液体溅出，把整个微孔板避光保存20 min，加入终止液H2SO450 μL，于波长450 nm处进行检测。手动换位检测1次/min，将上述过程重复2～3次，以减小误差。

1.4.2 吸光率的计算

B表示标准品的平均吸光度值；

B0表示阴性对照的平均吸光度值。

以氯霉素浓度的对数为横坐标，以标准品的百分吸光率为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 牛奶样品的前处理方法

利用不同的方法对牛奶样品进行前处理，制备用于分析的样品溶液。

1.5.1 方法一

取10 mL牛奶至离心管中，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋30 min，室温3500 r/min离心10 min。若两相之间出现乳化层，可将样品放在80 ℃水浴锅5 min。若未出现乳化层，则移取1 mL乙酸乙酯至10 mL的一次性管内，在旋蒸仪内蒸干，加入2 mL正己烷和2 mL复溶工作液溶解干燥物，除去上层，保留下层。

1.5.2 方法二

取10 mL牛奶至离心管中，室温3500 r/min离心10 min。加入0.40 mol/L亚铁氰化钾溶液300 μL、1.05 mol/L硫酸锌溶液600 μL，涡旋1 min。室温3500 r/min离心10 min，吸取上层清液至离心管中。

1.5.3 方法三

取10 mL牛奶至离心管中，加入250 μL乙腈，涡旋10 s使其混合。加入10 mL乙酸乙酯，涡旋30 min。室温3500 r/min离心10 min，吸取上层有机相2～10 mL，在旋蒸仪内蒸干。加入0.25 mL正己烷，加入复溶工作液即水-乙腈混合物(78∶22)0.25 mL，涡旋30 s。取2～10 mL移入离心管中，离心5 min，下层溶液用于分析。

1.5.4 方法四

取10 mL牛奶至离心管中，加入2 mL去离子水和8 mL乙酸乙酯，涡旋30 min，室温3500 r/min离心10 min，取上层清液2～10 mL，在旋蒸仪内蒸干，加入100 μL复溶工作液即水-乙腈混合物(78∶22)，涡动30 s。

1.6 氯霉素胶体金免疫层析法

从4 ℃冰箱拿出氯霉素胶体金免疫层析检测卡，恢复至室温，吸取80 μL样品溶液滴加在加样孔中，等待20～30 min，即可肉眼观察对照线T和检测线C的有无以及颜色变化。氯霉素胶体金免疫层析快速检测卡的灵敏度为0.1 ppb，样品检测完成后可能出现C、T检测线的显色和颜色变化，若样品中未含氯霉素或者含量低于检测线,则卡片结果为阴性，反之则为阳性(图1)。

图1 氯霉素胶体金试纸条示意图

1.7 ELISA法

(1)将酶联免疫试剂盒从4 ℃冰箱中取出，回温20 min，使用之前将各试剂摇晃均匀；(2)按照试剂盒说明书配制酶结合物工作液，现配现用；(3)加入处理好的牛奶待检溶液50 μL于微孔中，加入50 μL氯霉素单抗-HRP结合物，轻微振荡，用锡纸包裹放在暗处等待30 min；(4)每孔加入洗涤液250 μL，洗涤5次，每次间隔20 s，洗涤时应充分洗涤，避免误差；(5)分别加入50 μL TMB，微振，用锡纸包裹,放在暗处等待20 min；(6)加入终止液50 μL轻微敲打四周，微振(以防液体溅出)，为检测数据准确，应提前将酶标仪预热5 min，在波长450 nm处检测1次/min，连续检测3次为一组。

2 结果

2.1 胶体金免疫层析法检测结果

六种牛奶的氯霉素残留量检测结果均为阴性，表示六种牛奶不含有氯霉素或氯霉素的含量低于检测线。

2.2 ELISA法检测结果及四种前处理方法的比较

2.2.1 ELISA标准曲线的绘制

以氯霉素浓度的对数为自变量，以标准品的百分吸光率为因变量，进行回归分析，线性方程为y=-27.262x+48.243，相关系数R2为0.9893(图2)。

图2 ELISA法检测氯霉素的标准曲线

2.2.2 ELISA法的检测结果

选取一种牛奶样品，用1.5中的四种方法对牛奶样品进行前处理，然后用ELISA法对样品中氯霉素的含量进行检测，结果如表1所示。

表1 氯霉素的检测浓度

2.2.3 准确度测定

取一种已知氯霉素含量的牛奶样品，分为两组，分别加入50 μL或100 μL 100 ppb标准氯霉素溶液。根据1.5中的四种方法对牛奶样品进行前处理，用ELISA法检测样品中氯霉素含量，结果如表2所示，从两组数据可直观地看出,方法三的平均回收率最高，方法二的平均回收率最低。

表2 牛奶中的氯霉素回收率检测结果

如图3所示，加标量50 μL时，方法三相比方法一差异显著(P<0.01)，相比方法二差异极显著(P<0.05)。图4显示，加标量100 μL时，方法三相比方法二的结果显著差异(P<0.05)。无论加标量大小，方法三的平均回收率都是最高的。

图3 牛奶加标回收率结果对比(加标量50 μL)

图4 牛奶加标回收率结果对比(加标量100 μL)

2.2.4 精密度结果

如表3所示，牛奶前处理方法的批内变异系数在3.20%～6.31%之间，批间变异系数在4.99%～13.65%之间。方法三批内变异变异系数和批间变异系数分别为3.20%、4.99%，在四种方法中均最小，说明在四种方法中，方法三提取效果最好。

表3 不同牛奶前处理方法的精密度对比

3 讨论

畜禽长期使用抗生素会造成其加工生产的产品携带有抗生素[10]。人们长期食入含有抗生素的畜禽食品会影响身体健康[11,12]。人们对乳制品的需求量较大，牛奶中氯霉素残留量的检测很重要，本试验对市售六种牛奶氯霉素残留进行检测，并对四种前处理方法进行了比较，为牛奶卫生安全监督提供了技术支撑。

本试验中，我们选用了四种前处理方法，对比其提取效率，这四种方法中，氯霉素回收率区间为76.92%～98.58%，批内变异系数为3.20%～6.31%，批间变异系数为4.99%～13.65%，均小于15%。各方法回收率大小依次为：方法三>方法四>方法一>方法二，四种方法均达到国家标准。整体来看，方法三对牛奶中氯霉素的提取效果最好，该方法的准确度及精密度良好。

对氯霉素等半抗原的检测通常采用色谱分析法和免疫分析法。高效液相色谱(HPLC)和气-质联用(GC-MS)等色谱分析法需要较长的时间及昂贵的实验设备，被限制在实验室中使用[13,14]。免疫分析法已被广泛用于小分子物质的诊断检测，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)具有特异性强、灵敏度高和高通量等优点。以胶体金免疫层析技术(GICA)为代表的胶体金免疫层析试纸条使用方便、简单快速，适合于现场检测。