三种蛋白酶复配对牛肉嫩化效果的影响

高雪琴，刘航江，张雨菁，付 丽

(河南牧业经济学院，河南 郑州)

牛肉是优质且重要的肉类食物，牛肉中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养物质，而牛肉中的脂肪和胆固醇含量却比猪肉等肉类低[1]。中医认为，牛肉有补中益气、滋养脾胃、强健筋骨、化痰息风等功效，是食补佳品。

我国肉牛业经过几十年的发展，已基本形成独立的产业，在畜牧业中占比越来越大[2]。随着居民生活水平不断提高，人民的膳食结构有了很大改善，牛肉也因其丰富的蛋白质、维生素含量和较低的脂肪与胆固醇，越来越受到大众的欢迎。

虽然我国肉牛生产呈现良好的发展态势，但牛肉质量却没有快速提高。我国高档牛肉的份额还不到牛肉总产量的5%。牛肉的加工一直沿用传统的工艺，产品口感坚韧、肉质较老、纤维较粗，牛肉嫩度欠佳，严重影响到牛肉的食用品质[3]。国内餐厅所需的高档牛肉大都源于国外进口。

在提高牛肉品质的各个因素中，牛肉的嫩度影响很大，也是消费者评定肉质优劣的重要指标。牛肉的嫩化方法有很多种，如机械嫩化法、超高压嫩化法、超声波嫩化法、电刺激嫩化法、碳酸盐嫩化法、盐酸半胱氨酸嫩化法、多聚磷酸盐嫩化法、蛋白酶嫩化法、激素嫩化法等[4]。蛋白酶作为一种绿色、安全且高效的酶制剂广泛应用于肉制品加工行业，在提高肉制品嫩度、提升肉制品品质以及改善肉制品的风味上发挥着重要作用[5]。蛋白酶使用技术的发展也为肉制品的工艺优化、革新提供了技术支持。现在食品行业中应用较为普遍的酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶等。

不同蛋白酶具有较强的专一性。谢正林等[6]通过提取菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶，并对其进行嫩化对照处理，实验结果说明其提取的菠萝蛋白酶嫩化效果比木瓜蛋白酶好。Ha[7]研究发现木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、中华猕猴桃蛋白酶和菠萝蛋白酶四种植物蛋白酶都能有效地水解牛肉中的肌原纤维和胶原蛋白，其中木瓜蛋白酶水解肌原纤维蛋白质的效果较好，而生姜蛋白酶对结缔组织降解效果最好。李雨林等[8]通过相差显微镜镜检无花果蛋白酶和木瓜蛋白酶嫩化后的牛肉细胞的变化，并以剪切力为指标，发现无花果蛋白酶的嫩化效果明显优于木瓜蛋白酶，并对无花果蛋白酶的嫩化工艺进行了优化。优化工艺为在浓度0.01%、pH7.0、温度50 ℃的条件下嫩化处理2 h。徐静等[9]以剪切力为指标，对蛋白酶进行筛选后复配，最终筛选出无花果蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶进行复配，添加量分别为0.06%、0.1%、0.06%，并采用响应面分析数据得出最佳工艺：复合蛋白酶在添加量为0.04%，pH8.5，温度45 ℃，处理时间35 min的条件下，牛肉的剪切力达到最小值，此时牛肉嫩度最佳，牛肉的形态保持也相对完整，复合蛋白酶嫩化效果明显好于单一蛋白酶。

改善牛肉嫩度成为近年来学者研究的热点，在众多方法中，外源酶嫩化法因具有操作简单、不需要额外增加设备、基本不改变生产工艺、显著提高牛肉嫩度等优点，受到肉类研究者的重视[10]。目前关于蛋白酶嫩化肉制品效果的研究大多集中在单一蛋白酶上。不同的蛋白酶嫩化处理有各自的缺点与优点，并受周边环境的影响，而复合蛋白酶的嫩化效果可以弥补单一蛋白酶的缺点，比单一蛋白酶的嫩化效果更明显。但复合蛋白酶对牛肉嫩化效果的影响研究较少。

基于前人的研究，本实验以牛里脊肉为原料，选取木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶这三种嫩化效果较好的蛋白酶，对它们进行复合，以牛肉的剪切力、持水度、蒸煮损失为指标，研究最佳复合添加量配比及其最佳工艺条件，为复合蛋白酶嫩化肉制品的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

如表1所示。

表1 实验材料与来源

1.2 主要仪器

如表2所示。

1.3 实验方法

1.3.1 牛肉的预处理

选用新鲜的牛里脊肉，去除牛肉表面的脂肪、筋膜、软骨等物质，然后对牛肉进行切块、修整，使每块牛肉重量为50 g，且按照肌纤维方向切块，牛肉的大小形状保持一致。然后用自来水冲洗掉淤血，放入不锈钢盘子中沥去表面水分备用。

表2 实验仪器与来源

1.3.2 牛肉的嫩化处理

根据浓度要求用缓冲溶液配制成30 mL的酶液置于蒸煮袋中，放入预先处理好的牛肉块，使牛肉在酶液中酶解均匀，并根据实验需要，置于一定温度的恒温水浴锅中进行酶解。

1.3.3 蛋白酶的复配

在pH值为7.0，水浴温度40 ℃，酶解90 min的条件下，根据前人研究结果，从三种蛋白酶的酶添加量中选3个水平：菠萝蛋白酶添加量0.02%、0.03%、0.04%[11]；木瓜蛋白酶添加量0.02%、0.03%、0.04%[12]；无花果蛋白酶添加量0.01%、0.02%、0.03%[8]。设计三因素(三种酶)三水平(添加量)的正交实验，以剪切力为指标，摸索复合蛋白酶的最佳添加量配比。

1.3.4 复合蛋白酶单因素实验

以剪切力为指标，固定其它三个嫩化因素不变，分别对复合蛋白酶的添加量、处理时间、处理温度、处理pH进行单因素实验，得出每个单因素的最优水平，每个单因素实验不少于3个平行，并与空白组进行对照。

1)酶添加量的影响

将处理好的牛肉块分别浸泡于添加量为0.03%、0.06%、0.09%、0.12%、0.15%的pH7.0酶液中，在40 ℃条件下，酶解1.5 h，测剪切力值。

2)酶解时间的影响

将处理好的牛肉块浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL酶液中，在40 ℃、pH值为7.0条件下酶解0.5、1、1.5、2、2.5 h，测剪切力值。

3)酶解温度的影响

将处理好的牛肉块浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL、pH值为7.0的酶液中，在35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃条件下水浴到最佳时间后，测剪切力值。

4)酶解pH值的影响

将处理好的牛肉块浸泡在最佳酶添加量制成的30 mL酶液中，调节酶液pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在最佳温度下酶解最佳时间，测剪切力值。

1.3.5 复合蛋白酶的工艺条件优化实验

在单因素实验的基础上以牛肉的剪切力大小、牛肉持水度、蒸煮损失为指标，选取复合蛋白酶添加量、处理时间、处理温度、处理pH四个因素，每个因素取三水平设计四因素三水平正交实验，并对实验结果以综合平衡法进行分析，研究复合蛋白酶的优化工艺。

1.3.6 牛肉剪切力测定

参考付丽等[13]的方法并稍作改动。将嫩化处理后的牛肉，放入蒸煮袋中，尽量将袋中空气排出，放入80 ℃恒温水浴锅中加热，直至牛肉中心温度达到70 ℃后，保持10 min，取出牛肉，冷却至室温后，按肌纤维方向切成大小为1.5 cm×1.5 cm×2 cm的样品，质构仪测定TAP质构分析，每个样品测定3次，计算剪切力的平均值，并以没有嫩化处理的牛里脊肉作为对照。

质构仪测定参数：使用TA32/1000探头，TA-VBJ咬断夹具，测定TAP质构分析，探头运行方式为循环2次，下行速度5 mm/s，返回速度为5 mm/s，目标距离10.00 mm。

1.3.7 牛肉持水度测定

参考牛克兰[14]的方法并稍作改动，使用加压滤纸法进行测定。取10 g嫩化后的牛肉，用滤纸吸干表面水分后，对其重量W1进行精确称量，然后取干净纱布将肉样包裹两层，上下分别使用16层干燥滤纸将其夹住，置于肉品系水力测定仪加压平台上，加压50 kg，保持5 min，立即取出，精确称取重量W2，按照(式2-1)计算持水度。

持水度/%=(W1-W2)/W1×100

(式2-1)

式中：W1为肉样加压前的质量/g；W2为肉样加压后的质量/g。

1.3.8 牛肉蒸煮损失度的测定

称取一定量嫩化好的牛肉，用滤纸吸干其表面水分，精确称量其质量m1，放于蒸煮袋中，在80 ℃水浴锅中加热。当牛肉的中心温度达到70 ℃时，保持10 min，取出样品，冷却至常温，用滤纸擦干表面水分，然后精确称量其质量m2。蒸煮损失度按(式2-2)计算。

蒸煮损失度/%=(m1-m2)/mL×100

(式2-2)

2 结果与分析

2.1 蛋白酶复合的正交实验

蛋白酶复合的正交实验见表3、表4。

表3 蛋白酶复合正交实验因素水平表

表4 蛋白酶复合正交实验表

本实验以剪切力为指标，判断牛肉嫩度的大小，由表4可知，极差的大小为C>A>B，所以对牛肉嫩度影响力的强度为：菠萝蛋白酶对嫩度品质的影响最大，其次是无花果蛋白酶，木瓜蛋白酶对牛肉嫩度的影响相对较小。由于剪切力越小，牛肉的嫩度越好，根据k值的大小，可以看出复合蛋白酶嫩化牛肉的最佳配比为：A2B1C1，即复合蛋白酶的配比为：无花果蛋白酶添加量为0.02%、木瓜蛋白酶添加量为0.02%、菠萝蛋白酶添加量为0.02%。

2.2 复合蛋白酶的单因素分析

2.2.1 复合蛋白酶添加量的影响

如图1。实验结果表明，复合蛋白酶添加量对牛肉嫩化效果产生一定的影响。随着复合蛋白酶添加量的增加，牛肉的剪切力显著下降，当复合蛋白酶添加量为0.06%时，牛肉的嫩化效果较好，但随着复合蛋白酶添加量的增加，牛肉的剪切力变化虽然有所下降但是变化不大，且添加量过高时，牛肉形态有一定损坏。综合考虑，选择0.06%为复合蛋白酶的最佳添加量。

图1 复合蛋白酶添加量对牛肉嫩度的影响

2.2.2 复合蛋白酶嫩化时间的影响

如图2。实验结果表明，复合蛋白酶的酶解时间对牛肉的嫩化效果具有一定的影响，随着复合蛋白酶酶解时间的增加，牛肉的剪切力逐渐下降，嫩度较好，当嫩化时间为2.5 h时，牛肉的剪切力最小，并且还有下降趋势，但此时牛肉形态完整性较差，组织松散，综合考虑较为适宜的嫩化时间为1～2 h。

2.2.3 复合蛋白酶嫩化温度的影响

如图3。实验结果表明，复合蛋白酶嫩化时的温度对牛肉嫩度具有一定的影响。随着温度的上升，牛肉的平均剪切力逐渐下降，当温度为45 ℃时，牛肉的平均剪切力值最低，此时嫩度最好，但随着温度的上升，酶活性受到影响，牛肉的平均剪切力逐渐有所回升，超过50 ℃以后，变化较为明显。复合蛋白酶嫩化最适温度为45 ℃。

图2 复合蛋白酶嫩化时间对牛肉嫩度的影响

图3 复合蛋白酶嫩化时温度对牛肉嫩度的影响

2.2.4 pH对复合蛋白酶嫩化效果的影响

如图4，实验结果表明，复合蛋白酶嫩化时pH对嫩化效果也有一定的影响。随着pH值的增加，牛肉的平均剪切力逐渐下降。当pH值为8.0时，复合蛋白酶平均剪切力最低，说明接近复合蛋白酶的最适pH，当pH为9.0时，平均剪切力有所回升。所以选pH8.0为复合蛋白酶最适pH。

图4 复合蛋白酶嫩化时pH对牛肉嫩度的影响

2.3 复合蛋白酶工艺条件优化实验

根据单因素实验结果，选取对实验结果有影响的因素作为正交实验的因素，并在最优水平的基础上，选取上下两个有嫩化意义的水平，进行下一步的正交实验，如表5、表6。

表5 复合蛋白酶嫩化条件正交实验因素水平表

表6 复合蛋白酶正交实验结果

由表7可知，不同的因素对三种指标的影响程度是有一定差异的，不同指标所对应的优化方案也是不同的，因此需要对此次实验的结果进行综合平衡，分析如下：

因素A：在三个实验指标中A因素均为较次要因素。相比较之下，A因素对持水度的影响稍大，仅次于D因素，且A因素和D因素极差值相近，明显大于B因素和C因素，A因素的三个水平相差较大。而在剪切力和蒸煮损失度这两个指标中，A因素的影响力明显靠后，且各水平间相差不大。所以选取A1。

因素B：对于这三个实验指标而言，都是以B3为最佳水平，所以B因素取B3。

因素C：对于持水度和蒸煮损失率这两个实验指标，都是取C1为佳，而且对于蒸煮损失率这个指标，C因素是最主要的因素，在确定最优水平时应着重考虑。对于剪切力来说，取C3为好，从Ki(ki)可以看出，C因素取C1和C3时，剪切力相差不大，而且从极差值来看，C因素为较为次要的因素。所以根据多数倾向和C因素对不同指标的重要程度，选取C1。

表7 复合蛋白酶正交实验结果分析

因素D：对于剪切力和持水度这两个指标，D因素均为最主要影响因素，且都是取D2好。对于蒸煮损失率，D因素的k1、k2值分别为43.29和43.39，可以看出D取D1、D2时，蒸煮损失率相差不大，且从极差来看，D为较次要因素。所以综合多数据影响的因素，D值取D2。

综合上述分析，优方案为A1B3C1D2，即复合蛋白酶添加量为0.06%(无花果蛋白酶0.02%(100 U/g)、木瓜蛋白酶0.02%(20 U/g)、菠萝蛋白酶0.02%(20 U/g))、嫩化时pH值为9.0、嫩化时温度40 ℃、嫩化时间2 h。

3 结论

本实验首先通过三因素三水平的正交实验，将木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶进行复配，研究出复合蛋白酶的最佳添加量配比，即无花果蛋白酶0.02%(100 U/g)、木瓜蛋白酶0.02%(20 U/g)、菠萝蛋白酶0.02%(20 U/g)。再对复合蛋白酶进行单因素实验，结果表明复合蛋白酶的添加量、嫩化时温度、pH值、嫩化时间均对复合蛋白酶的嫩化效果产生影响。当复合蛋白酶添加量为0.06%时，牛肉剪切力达到最低；嫩化时间为2 h时，综合剪切力与组织状态达到最好水平；当pH值为8时，牛肉剪切力达到最低；当嫩化温度为45 ℃时，剪切力达到最低水平。

复合蛋白酶的正交实验与未经嫩化处理的对照组相比，复合蛋白酶对牛肉嫩化效果具有明显影响。嫩化处理的时间对牛肉的剪切力以及持水度影响最大，当嫩化时间过长时牛肉的形态完整性受到破坏，因此牛肉失水较多，持水力差。处理温度对烹饪损失影响最大，温度过高或过低时，会影响到酶的活性，从而对牛肉的剪切力、持水度、烹饪损失产生影响。

通过综合平衡法对正交实验结果分析得出，复合蛋白酶的最佳工艺条件为：在添加量为0.06%、40 ℃、pH值为9.0的条件下，嫩化2 h。