河南省部分奶牛场青贮饲料黄曲霉毒素B1污染情况调查

张 洋，刘进辉，皇甫和平，李新锋，李志强，闫跃飞，刘 欢，石冬梅

(1.湖南农业大学 动物医学院，湖南 长沙 410128；2.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；3.河南省奶牛生产性能测定中心，河南 郑州 450046)

黄曲霉毒素是由曲霉菌属中的黄曲霉和寄生曲霉在高温高湿环境下快速繁殖产生的次级代谢产物，其污染的饲料种类很多，主要是花生饼、粕、干酒糟、棉籽粕和青贮饲料等[1,2]。在所有的黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)危害最大，毒性最强，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍、三聚氰胺的416倍；致癌力为二甲基亚硝胺的70倍，六六六的1000倍，诱发肝癌的能力相当于3，4-苯并芘的4000倍[3]。

AFB1污染日益受到人们的重视，2009—2011年从美洲、欧洲和亚洲采集的7049个家畜饲料样品中，81%的样品至少检出一种霉菌毒素[4]；朱风华等[5-7]于2014—2018年连续检测了山东地区饲料原料和配料中AFB1、玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇，发现上述毒素均有不同程度超标；奶牛采食被霉菌毒素污染的饲料后容易引发多种疾病，有些霉菌毒素还会进入牛奶中对人类健康造成威胁。查满千等[8]研究发现，AFB1对奶牛的消化系统、免疫机能和生产性能均会造成不同程度的影响；张养军等[9]研究发现，AFB1对奶牛可能产生致畸、致癌和致突变的影响，不利于奶牛业的健康发展。因此定期开展对奶牛场饲料中霉菌毒素污染的检测工作十分必要。

为了解近年来河南省奶牛场饲料中AFB1的污染情况，本研究对2019—2020年度河南省5个地区奶牛场的青贮饲料进行AFB1检测，以探索河南省全株玉米青贮饲料中AFB1的分布规律及污染现状，为评价青贮饲料质量以及防制的AFB1污染，为奶牛健康养殖提供科学参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

AFB1酶联免疫试剂盒购自北京维德维康生物技术有限公司；CT293粉碎机购自Foss公司；3K15高速冷冻离心机购自Sigma公司；MR-96A酶标仪购自Bio Tek公司。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

严格按照国家饲料采样标准[10]，对河南省5个地区(豫东、豫西、豫南、豫北、豫中)15个城市的69家奶牛场进行采样，共计采集全株玉米青贮饲料109份(表1)。

表1 样品采集情况列表

1.2.2 样品制备

将较大的玉米青贮用剪刀剪碎至3 cm以内，样品充分混匀。首先用4分法进行样品缩小(混合次数至少4次以上)，混合均匀后把样品4等分然后取对角2份样品，将分离得到的样品放入盘中进行称重，然后65 ℃烘箱烘干至少8小时，再次称重。将烘干的样品全部粉碎、过筛后封存待检。

1.2.3 样品中AFB1的萃取

每份称取粉碎好的样品5 ± 0.01 g倒入50 mL离心管中，加入25 mL 70%甲醇水溶液，用涡旋仪使样品和甲醇充分混合，然后静置1小时，使饲料中的AFB1充分萃取，离心进行物质分层，上层为上清液，下层为全株玉米粉末，上清液为待检样品。

1.2.4 样品中AFB1的检测(酶联免疫吸附法)

(1)将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，未使用的板条用自封袋密封，保存于2～8 ℃环境中；

(2) 将50 μL各标准品工作液/样品溶液分别加入对应的标准品/样品孔中；

(3) 在每孔中加入50 μL显色酶标记物工作液；

(4) 在每孔中加入50 μL标准抗体工作液；

(5) 盖好盖板膜，轻轻震荡酶标板10 s充分混匀，室温下(25±2 ℃)避光反应30 min；

(6) 揭开盖板膜，倒掉板孔中液体，在每孔中加入260 μL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15～30 s；

(7) 倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；

(8) 立即在每孔中加入 标准A液和B液1∶1的混合液100 μL；

(9) 盖好盖板膜轻轻振荡酶标板10 s充分混匀，室温下(25±2 ℃)避光反应15～20 min；

(10) 揭开盖板膜，在每孔中加入50 μL终止液，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀；

(11) 终止后5 min内用酶标仪在双波长450 nm和630 nm下读取酶标板吸光度值。

2 结果

2.1 样品检测结果

参照试剂盒的检测限3 μg/kg，109份样品的检测结果显示39份为阴性样品，70份为阳性样品。70份阳性样品中，其中有5份样品在我国规定饲料的限量值(30 μg/kg)以上，超标样品检测结果见表2。

表2 超标样品的检测结果

2.2 统计分析结果

不同地区样品检出率、超标率、场检出率、场超标率、平均值和最大值等数据见表3。总体样品阳性率为64.22%(70/109)，总体奶牛场阳性率为66.67%(46/69)，总计有5份样品AFB1含量超出我国规定的饲料AFB1限量值(30 μg/kg)。总体样品超标率为4.59%(5/109)，46个阳性场中有4个场样品中的AFB1含量超出我国规定的饲料限量，总体场超标率为5.80%(4/69)。

5个地区的样品阳性率由低到高依次为豫西(36.84%)、豫中(57.89%)、豫南(58.33%)、豫北(75.00%)和豫东(92.30%)；样品超标率由低到高依次为豫西(0%)、豫南(0%)、豫中(5.26%)、豫北(6.81%)和豫东(7.69%)；样品中AFB1平均含量由低到高依次是豫西(2.92 μg/kg)、豫南(4.84 μg/kg)、豫中(7.74 μg/kg)、豫北(10.11 μg/kg)和豫东(11.59 μg/kg)。

3 讨论与结论

此次调查结果显示总体样品阳性率为64.22%，总体样超标率为4.59%；用卡方检验统计法得知河南省不同地区样品阳性率和超标率差异显著(P≤0.05)，5个地区的样品阳性率为豫西36.84%、豫中57.89%、豫南58.33%、豫北75.00%、豫东92.30%，样品超标率豫西0%、豫南0%、豫中5.26%、豫北6.81%、豫东7.69%，这表明河南省5个地区奶牛场青贮饲料AFB1污染分布广泛，但总体污染程度较轻，其中豫东、豫北、豫中地区污染相对较为严重。该结果与近年来其他学者研究结果一致，刘凤兰等[10]调查2017年我国部分地区饲料及饲料原料中霉菌毒素的污染情况，发现青贮饲料和发酵料AFB1检出率90.7%，超标率为0%，结果表明青贮饲料和发酵料存在AFB1轻度污染。李思齐等[11]采集了鲁北地区18家养殖场的青贮样品，通过酶联免疫吸附试验检测发现，AFB1检出率55.6%，超标率5.6%，该地区AFB1污染情况较轻。吴开开等[12]调查了甘肃部分地区规模化奶牛场饲料霉菌毒素的污染情况，青贮玉米秸中AFB1检出率为78.43%，结果表明青贮玉米秸中存在霉菌毒素轻度污染。

表3 河南省青贮饲料中AFB1不同地区调查情况

青贮饲料制作的多个环节都有可能引起霉菌污染，如新鲜的玉米密封发酵制成青贮的过程中，如果制作流程不规范或储存不当，高温高湿的环境很容易滋生霉菌，从而产生霉菌毒素。因此，在青贮收割储存过程中，要严格做好青贮AFB1污染防制工作，减少和避免AFB1对人类健康造成的危害。

饲料中霉菌毒素分布存在不均匀性和动态性，取样环节易产生的较大误差，因此样品的采集和制备非常重要。为了减少采样过程中造成的误差，采样人必须佩戴一次性手套，不同样品间更换手套，防止交叉污染，并随时清洁采样工具。在样品采集时，按照国标要求[13]，反刍动物青贮粗饲料的最小实验室样品采样量应大于1 kg，进行青贮窖、青贮堆内采样时应确保产品的各层均被覆盖，采用9点采样法进行采样。

为了减少霉菌毒素的危害，在收取、保存玉米青贮时，要注意以下几点：在收取青贮时要注意天气、温度、湿度，尽量选择在天气干燥，无雨水时期收刈，收取青贮时应该剔除发霉的全株玉米。李宝明等[14,15]研究认为，添加乳酸菌能够加快玉米青贮的发酵酸化过程，不仅快速降低了PH值，使杂菌生存受到抑制，AFB1的产生受到约束，减短腐败菌有氧发酵3至5天，而且还降低了5%～10%营养物质的损失。不仅如此，李旭业等[16]研究发现，添加乳酸菌制备青贮全株玉米能显著提高饲料的粗蛋白含量。因此，制作青贮饲料时，可加入乳酸菌种等适量发酵剂。

通过此次调查，在一定程度揭示了2019—2020年河南地区奶牛场全株玉米青贮AFB1的污染情况。值得广大奶牛场注意的是2021年7月份以来河南省雨水过多，时间过长，导致多地玉米、花生的生长受到影响，外观霉变现象严重，这提醒我省奶牛场更要注意饲料的收储工作，做好防霉和脱霉工作，以保障牛群健康和养殖效益。