一次性生物工艺袋储存Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗的稳定性研究

王虓宇，朱云，沈武玲，张名，蔡玮，赵云蓉，刘畅，卢振攀，张明珠，平玲

近年来，随着医药卫生事业的快速发展，人们对医药产品的质量要求越来越高，对药用包装材料的质量也提出更高要求[1]。生物制药工艺从上游的培养基制备、细胞培养到下游纯化、灌装等一系列工艺来看，目前市场上有很多涉及生物制药行业的厂商都可以提供全线的一次性使用系统。

我所自 2015年 Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗（sIPV）上市以来，在该制品的生产过程中使用高硼硅玻璃瓶对单价原液进行长期储存，用不锈钢储运罐进行三价半成品配制和暂存。而玻璃瓶和储运罐的清洗、高压灭菌、取样、溶液混匀和清洁验证等工序较繁琐，准备的周期较长，消耗人力物力。一次性生物工艺袋（或混合袋）因其广泛的化学兼容性[2]，主要用于疫苗、生物制剂等药品的混合、长期保存、生物反应器的补液和收获等，操作简单。与传统玻璃瓶和不锈钢器材相比，它具有成本效益高、灵活、安全、对环境影响小、供应链多样性的优势。当前市场上一次性生物工艺袋由多层高分子材料组成，厂家可提供产品提取实验、迁移性及吸附性实验结果[3-5]。但是，由于可提供一次性生物工艺袋的厂家较多，生物工艺袋的材料不尽相同，不同结构材料制成的生物工艺袋的外观、色泽、澄明度与机械强度亦存在不同。本实验通过在不同储存条件和不同储存时间下使用三种品牌的一次性生物工艺袋对 sIPV 原液、三价半成品进行存储，探讨其对制品稳定性的影响，为生物工艺袋是否适用于 sIPV 工艺提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 生物工艺袋 生物工艺袋由 PALL、Sartorius、Saint-Gobain 三个生产厂家提供，均为250 ml 容量规格。其中 PALL 生产的生物工艺袋产品接触层至空气阻隔层材料依次为超低密度聚乙烯（ULDPE）层、乙烯-乙烯醇共聚物（EVOH）层、ULDPE 层和聚酰胺（PA）层；Sartorius 生产的生物工艺袋依次为聚乙烯（PE）层、EVOH 层；Saint-Gobain 生产的生物工艺袋依次为低密度聚乙烯（LDPE）层、EVOH 层和 PA 层。

1.1.2 原液 I 型、II 型、III 型 sIPV 单价原液由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品四室提供，均由病毒纯化液灭活后获得。

1.1.3 三价半成品 sIPV 三价半成品由中国医学科学院医学生物学研究所生物制品四室提供。三个型别 sIPV 单价原液与 M199 溶液按一定比例混合，加入 2-苯氧乙醇溶液至终浓度 5 mg/ml，混合均匀后配制完成。

1.1.4 主要试剂及仪器 Lowry 法蛋白含量测定试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；Vero 细胞蛋白残留量检测试剂盒购自北京天坛生物制品股份有限公司；牛血清白蛋白残留量测定试剂盒购自江苏无锡博生医用生物技术开发有限公司；硫酸卡那霉素残留检测试剂盒购自北京勤邦生物技术有限公司；DNA 抽提试剂盒购自瑞士 Roche公司；Vero 细胞 DNA 残留量测定标准品由中国食品药品检定研究院提供；酶标仪购自美国 Biotek公司；96 孔酶标板购自美国 Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 sIPV 原液分装 sIPV I 型、II 型、III 型单价原液各一批（批号分别为 AIS20151001、AIS20152001、AIS20153001）分装到三个品牌的生物工艺袋中（规格为 250 ml/袋，每袋原液装量100 ml），每个品牌分装 3 袋。

1.2.2 sIPV 三价半成品配制及分装 取上述sIPV I 型、II 型、III 型单价原液，按照质量标准配制一批三价半成品（批号为 IS 半2015001）。将三价半成品分别分装到三个品牌的生物工艺袋中，每个品牌分装 9 袋（3 个温度条件，每个条件各 3 袋）。

1.2.3 单价病毒原液稳定性实验 sIPV 原液的储存条件及效期为 2 ～ 8 ℃ 下 1年。本研究中，将 I、II、III 型单价原液样品放置于 2 ～ 8 ℃ 条件下 15 个月，分别在第 0 天、3、6、9、12 和15 个月检测无菌实验、D 抗原含量，以评价原液关键质量指标是否符合要求。

1.2.4 三价半成品稳定性实验 sIPV 三价半成品配制完成后暂存于 2 ～ 8 ℃ 不超过 72 h 须进行灌装。按照 2015 版《中华人民共和国药典》第四部 9001《原料药与药物制剂稳定性实验指导原则》和《药品包装材料与药物相容性实验指导原则》[6]的要求，对贮存袋中的样品进行不同温度、不同时间的稳定性考察[7-8]。

1.2.4.1 三价半成品 2 ～ 8 ℃ 长期稳定性实验 将三价半成品样品分装于一次性生物工艺袋内，放置于 2 ～ 8 ℃ 条件下 36 个月，第 0、24、36 个月检查外观，进行 2-苯氧乙醇、游离甲醛、Vero 细胞 DNA 残留量、Vero 细胞宿主蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量、大鼠效力实验；在第 3 天和第 5 天进行无菌实验和D 抗原含量检测；在第 6、9、12、18、24、36 个月检测 pH、蛋白含量、无菌实验、细菌内毒素、D 抗原含量、异常毒性实验[9-10]。

1.2.4.2 三价半成品 25 ℃ 加速稳定性实验 在（25 ± 2）℃、相对湿度（60 ± 5）% 条件下，对三价半成品于第 1、2、3、6 个月检查外观、检测 pH、无菌实验、细菌内毒素、D 抗原含量；第 6 个月增加异常毒性实验和大鼠效力实验。

1.2.4.3 三价半成品 37 ℃ 加速稳定性实验 在（37 ± 2）℃，相对湿度（75 ± 5）% 条件下，对三价半成品于第 7、14 天检查外观、检测 pH、无菌实验、细菌内毒素、D 抗原含量；第 14 天增加异常毒性实验和大鼠效力实验。

1.2.5 D 抗原检测 采用双抗体夹心 ELISA法，以参考品 D 抗原含量为横坐标，对应的A450值为纵坐标，采用四参数法拟合标准曲线并获得曲线方程。再根据样品A450值计算样品的 D 抗原含量。每个品牌工艺袋各个温度条件在每个时间点，自 3 个袋内各取一份样品进行独立检测，计算3 个检测结果的均值即为相应条件该时间点的 D抗原含量。

1.2.6 细菌内毒素、Vero 细胞宿主蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量及抗生素含量测定 参照相应试剂盒说明书进行。

1.2.7 无菌实验、2-苯氧乙醇、游离甲醛、蛋白含量、Vero 细胞 DNA 残留量、异常毒性实验、大鼠效力实验 参照《中国药典》三部（2015 版）通则进行检测。

1.3 统计学处理

采用 Graphpad prism 软件进行数据分析并绘图。以不同品牌作为不同处理组，在不同温度下对稳定性考察过程中样品的 D 抗原回收率数据进行One-way ANOVA 分析，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。D 抗原回收率计算公式如下所示：回收率（%）= 待测样品 D 抗原含量/分装前初始样品D 抗原含量 × 100%。

2 结果

2.1 单价病毒原液稳定性实验结果

将三个品牌装有 sIPV I、II、III 型单价原液的一次性生物工艺袋放置于 2 ～ 8 ℃ 冰箱内，分别在规定的时间点取样进行检测。无菌检查合格；I、II、III 型 D 抗原检测结果在 15 个月时均在质控范围内；对 D 抗原回收率（表1）进行统计学分析，在 15 个月内各个时间点组间差异不显著（P＞0.05），因此使用三种品牌中任意一种一次性生物工艺袋作为 sIPV 单价原液的存储容器，对 D 抗原含量的影响无显著性差异。

目前 sIPV 原液使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃瓶储存，根据前期生产验证结果和工作成果[11]，将 2 ～ 8 ℃ 条件下贮存 15 个月高硼硅玻璃瓶储存原液稳定性数据与三个品牌一次性生物工艺袋的稳定性数据共四组进行组间比较（表1），I 型、II 型、III 型 D 抗原回收率在 15 个月内组间差异不显著（P＞ 0.05）。

表1 一次性生物工艺袋和高硼硅玻璃瓶在 2 ～ 8 ℃ 下储存 sIPV 单价原液 15 个月 D 抗原回收率Table 1 The results of recovery rate of D antigen of three brands single-use bags containing monovalent bulk of sIPV and in high borosilicate glass bottles stored at 2 - 8 ℃ for 15 months

2.2 三价半成品 2 ～ 8 ℃ 长期稳定性实验结果

将三个品牌一次性生物工艺袋装入配制好的sIPV 三价半成品放置于 2 ～ 8 ℃ 冰箱内，分别在规定的不同时间点取样进行检测。肉眼观察三个品牌一次性生物工艺袋包装的样品外观都呈橘红色，澄清透明，无异物；取样检测结果：pH 值在 6.5 ～7.5 内，符合范围；无菌检查合格；细菌内毒素＜ 20 EU/ml，2-苯氧乙醇在 4.0 ～ 6.0 mg/ml 范围内，游离甲醛 ＜ 50 μg/ml，蛋白含量 ＜ 20 μg/ml，Vero 细胞 DNA 残留量 ＜ 100 pg/ml，牛血清白蛋白残留量 ＜ 100 ng/ml，抗生素残留量 ＜ 100 ng/ml，以上检测结果均在合格范围内；异常毒性实验结果合格，24 个月时大鼠效力实验 3 个型别 ED50仍高于参考品 ED50。I 型、II 型、III 型 D 抗原检测结果在 24 个月时均在质控范围内，不同品牌工艺袋对 D 抗原含量的影响无显著性差异。保存至36 个月，I 型和 II 型 D 抗原含量仍在质控范围内，III 型 D 抗原含量已低于质控标准下限（图1）。

图1 sIPV 三价半成品储存于 3 个品牌一次性生物工艺袋于 2 ～ 8 ℃ 保存 36 个月的 D 抗原稳定性结果（两条水平线分别表示 sIPV 三价半成品中 D 抗原标准的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 1 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV stored in three brands of single-use bags at 2 - 8 ℃for 36 months (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV)(A: Type I; B: Type II; C: Type III)

2.3 三价半成品 25 ℃ 加速稳定性实验结果

将三个品牌一次性生物工艺袋装入配制好的sIPV 三价半成品放置于（25 ± 2）℃、相对湿度（60 ± 5）% 的恒温箱内 6 个月，分别在规定的不同时间点取样进行检测。肉眼观察袋内样品，外观均呈橘红色，澄清透明无异物；取样检测结果：pH值在 6.5 ～ 7.5 内，符合范围；无菌检查合格；细菌内毒素 ＜ 20 EU/ml；检测结果在合格范围内；异常毒性实验结果合格；6 个月时大鼠效力实验ED50高于参考品 ED50。I 型、II 型、III 型 D 抗原检测结果在 6 个月时均在质控范围内（图2）。

图2 sIPV 三价半成品储存于 3 个品牌一次性生物工艺袋于（25 ± 2）℃ 保存 6 个月的 D 抗原稳定性结果（两条水平线分别表示 sIPV 三价半成品中 D 抗原标准的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 2 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV stored in three brands of single-use bags at 25 ℃ for 6 months (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV) (A: Type I; B: Type II; C: Type III)

2.4 三价半成品 37 ℃ 加速稳定性实验结果

将三个品牌一次性生物工艺袋装入配制好的sIPV 三价半成品放置于（37 ± 2）℃、相对湿度（75 ± 5）% 的恒温箱内 14 d，分别在规定的不同时间点取样进行检测。肉眼观察袋内样品，外观均呈橘红色，澄清透明无异物；pH 值在 6.5 ～ 7.5 内，符合范围；无菌检查合格；细菌内毒素 ＜ 20 EU/ml，检测结果在合格范围内；异常毒性实验结果合格；14 d 时大鼠效力实验 ED50高于参考品 ED50。sIPV 半成品储存于一次性生物工艺袋内，在 37 ℃保存 14 d 后，I 型、II 型、III 型 D 抗原仍然均在质控范围内（图3）。

图3 sIPV 三价半成品储存于 3 个品牌一次性生物工艺袋于（37 ± 2）℃ 保存 14 d 的 D 抗原稳定性结果（两条水平线分别表示 sIPV 三价半成品中 D 抗原标准的上下限）（A：I 型；B：II 型；C：III 型）Figure 3 The steability of D antigen content of final formulated bulk of sIPV in three brands of single-use bags stored at 37 ℃ for 14 days (The two horizontal lines represent the upper and lower limits of D antigen content of final trivalent bulk of sIPV) (A: Type I;B: Type II; C: Type III)

2.5 在不同温度稳定性考察终点三价半成品的 D抗原回收率结果

以不同品牌一次性生物工艺袋作为分组，对不同温度保存至稳定性考察时间终点的样品 D 抗原回收率（表2）进行统计学分析。结果显示，至长期稳定性考察和加速稳定性考察的终点，I、II 和III 型 D 抗原回收率在三个品牌一次性生物工艺袋组间差异不显著（P＞ 0.05），因此，三种品牌一次性生物工艺袋作为 sIPV 三价半成品的存储容器，对 D 抗原含量稳定性的影响均无显著性差异。

表2 装有 sIPV 三价半成品的 3 种品牌一次性袋于（37 ± 2）℃ 储存 14 d、（25 ± 2）℃ 储存 6 个月和 2 ～ 8 ℃ 储存 36 个月的 D 抗原回收率Table 2 Recovery rates of D antigen of final trivalent bulk of sIPV in three brands single-use bags stroed at 37/25/2 - 8 ℃ for 14 d/6 months/36 months

目前，sIPV 三价半成品所使用的配制容器是规格为 120 L 的不锈钢储运罐，根据前期验证工作和三价半成品配制后抽样数据，将 2 ～ 8 ℃ 条件下贮存 3、5 d 时的不锈钢储运罐装三价半成品 D抗原回收率数据与相同条件下三个品牌一次性生物工艺袋的 D 抗原回收率数据共四组进行组间比较（表3），I 型、II 型、III 型 D 抗原回收率在组间差异不显著（P＞ 0.05），因此三种品牌一次性生物工艺袋作为 sIPV 三价半成品的存储容器与不锈钢储运罐相比，2 ～ 8 ℃ 暂存 5 d 内对 D 抗原含量稳定性的影响均无显著性差异。

表3 装有 sIPV 三价半成品的 3 种品牌一次性袋和不锈钢储运罐在 2 ～ 8 ℃ 下暂存 3、5 d 时 D 抗原回收率Table 3 Recovery rates of D antigen of final trivalent bulk of sIPV in three brands single-use bags or mobile tanks stored at 2 - 8℃ for 3/5d

3 讨论

目前我所在生产 sIPV 疫苗的过程中，中间产品 Sabin 株脊髓灰质炎 I 型、II 型、III 型单价原液使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃容器储存，保存条件 2 ～ 8 ℃ 下有效期 1年；三价半成品使用不锈钢储运罐储存，暂存于 2 ～ 8 ℃ 下有效期 3 d。存储容器按重复使用的模式进行管理，使用后及时清洗，每次使用前还须经过纯化水、注射用水清洗，组装完毕后经过保压测试后进行湿热灭菌，灭菌后使用前再进行保压测试，测试通过后才能投入使用。整个过程步骤多且繁琐，同时需要对所涉及的容器进行定期的清洁验证和灭菌效果验证，耗费较多人力物力。另外玻璃容器在转运过程中有碎裂的风险，一旦发生碎裂就会造成较大经济损失。

生物工艺袋出厂时经过辐照灭菌和完整性测试，减少了传统容器盛放中间产品所不可避免的清洗、灭菌、验证等步骤所带来的繁琐操作，且为抽真空处理，使病毒原液或三价半成品存放在容器内时残留的空间达到最小限度，有效降低 pH 值的变化。生物工艺袋还可以订制多个一次性连接管和多个一次性取样袋，在溶液转移或配制时无须开口操作，减少污染风险，并且多个一次性取样口使得取样操作不需要在 A 级洁净环境下进行，操作方便快捷。另外，生物工艺袋可选配自带非接触式磁力搅拌浆叶的混匀袋，相比不锈钢储运罐采用的间歇式通气混匀模式而言，在配制或分装过程中使溶液持续混匀的操作更为方便有效，且不会因为搅拌桨叶旋转过程发生摩擦而脱落微粒[12]。

本研究中使用的三个品牌一次性生物工艺袋储存 sIPV 单价原液，在 2 ～ 8 ℃ 下保存 15 个月，D 抗原回收率同使用 10 L 或 20 L 高硼硅玻璃瓶稳定性数据相比，组间差异不显著（P＞ 0.05），检测结果均达到我所质量标准；三价半成品在（37 ±2）℃、相对湿度（75 ± 5）% 14 d 及（25 ± 2）℃、相对湿度（60 ± 5）% 保存至 6 个月的加速稳定性考察实验中，全部项目检测结果均达到我所质量标准；2 ～ 8 ℃ 保存至 24 个月的稳定性考察实验中，三个型 D 抗原含量仍符合质量要求；各项检测指标均符合《中国药典》三部（2015 版）相关要求。实验结果说明长时间储存疫苗时，三个品牌一次性生物工艺袋的接触层对疫苗稳定性均无显著影响，原液及三价半成品可在储液袋中长期稳定保存。将各品牌一次性生物工艺袋三价半成品 D 抗原回收率与 sIPV 现使用的不锈钢储运罐稳定性数据进行比较，组间差异不显著（P＞ 0.05），其余各项检测结果均达到我所质量标准。使用一次性生物工艺袋能够满足生产工艺规程中的各项质量标准，相关数据可以为一次性生物工艺袋用于 sIPV 单价原液的储存和三价半成品的配制及存储提供支持。