不同代谢活化条件对N-亚硝胺类化合物细菌回复突变结果的影响

叶倩，汪祺，文海若

亚硝胺类化合物由亚硝酸盐或氮氧化物等与胺类物质反应后生成，该反应可存在于药品生产中的各个环节，来自原料药的生产试剂、降解产物、包装材料等。近年来，多种药品中可发现 N-亚硝基二甲胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）[1]，作为药品杂质其遗传毒性风险以及监管限度的确定受到广泛关注。除 NDMA 外，亚硝胺类化合物包括 N-亚硝基二乙胺（N-ethyl-N-nitrosoethanamine，NDEA）、N-亚硝基二丁胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亚硝基二异丙胺（N-nitrosodiisopropylamine，NDIPA）、N-亚硝基乙基异丙基胺（N-nitrosoethyl isopropyl amine，NEIPA）等 120 余种。国际癌症研究机构（international agency for research on cancer，IARC）将亚硝胺类化合物列为 2A 类致癌物，已有动物致癌数据，且机制研究提示其存在致癌风险[2]。在监管方面，参考人用药品注册技术要求国际协调会发布的 ICH M7（2017年），亚硝胺类化合物属于较高致癌风险的“关注队列”（cohort of concern，COC）[3]。NDMA 和 NMBA 根据其大鼠的 50%致癌剂量（median toxic dose，TD50）值折算，成人每日最大摄入量不超过 96 ng；NDEA、NDBA、NDIPA 和 NEIPA 则为 26.5 ng[4]。

然而，并非所有亚硝胺类化合物均存在致突变性[5]。随着对药品中亚硝胺类杂质控制的重视，明确某个亚硝胺类化合物是否具有致突变性是界定其监管限度的关键。细菌回复突变试验（又称 Ames试验）是最常用的评价化合物是否具有基因突变风险的方法[6]。亚硝胺类化合物的致突变性主要与其代谢产物有关，其中 CYP2E1 为主要代谢酶[7-8]。大鼠肝微粒体 S9是最常用的 Ames 试验的代谢活化系统，但鉴于不同种属的 S9中所表达的酶含量有所不同，其对 N-亚硝胺类化合物的代谢能力有待考察。此外，常规的 Ames 试验多采用平皿掺入法，为保证 S9与亚硝胺类化合物充分作用，文献建议亚硝胺化合物的 Ames 试验使用预培养法开展[9]。然而上述研究数据较为陈旧，对当前的试验指导不佳。本研究以 NDMA 和 NDEA 为例，比较不同种属来源 S9以不同培养方法对 Ames试验结果的影响，为致突变活性与代谢活化有关的物质的 Ames 试验条件确立提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型（his-）菌株 TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535和 TA1537 引自日本（株）生物科学中心（JBSINC），经分离筛选后对其是否存在氨基酸及生物素合成缺陷、细胞壁脂多糖缺失（rfa）、紫外线（uvrA或△uvrB）修复缺陷、抗氨苄青霉素及抗四环素（含 pKM101 或 pAQ1 质粒）等特性进行鉴定，鉴定结果符合要求后用于试验[10]。

1.1.2 试剂和仪器 受试物 NDMA（纯度 ＞95%）、NDEA（纯度 ＞ 95%）均购自中国食品药品检定研究院；溶媒及阳性对照试剂二甲基亚砜（DMSO）、2-2-(呋喃基)-3-(5-硝基-2-呋喃基)丙烯酰胺（2-2-furyl-3-5-nitro-2-furylacrylamide，AF-2）、2-氨基蒽（2-aminoanthracene，2-AA）、组氨酸、色氨酸、生物素、NADP、G-6-P 均购自美国 Sigma公司；叠氮钠（NaN3）购自美国 Merck 公司；9-氨基吖啶（9-aminoacridine，9-AA）购自 Acros Organics 公司；营养肉汤（CM0067 nutrient broth No.2）购自英国 Oxoid 公司；琼脂粉、葡萄糖购自北京索莱宝科技有限公司；MgSO4·7H2O、C6H5Na3O7·2H2O、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、(NH4)2SO4、KCl、MgCl2均购自国药集团；CD-1 小鼠/SD 大鼠肝 S9混合液（由苯巴比妥钠和 β-萘黄酮联合诱导小鼠或大鼠肝脏制成）及人肝 S9混合液购自江苏齐氏生物科技有限公司。

HERA cell VIOS 160i 二氧化碳培养箱为Thermo Fisher 公司产品；NU-543-400S 生物安全柜为 Nuair 公司产品；MIR-253 恒温培养箱为三洋公司产品；CKX31 倒置显微镜为 Nikon 公司产品；NTS-1300 水浴摇床为 Eyela 公司产品；IS600细菌培养箱为 Yamato 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌回复突变试验 琼脂及溶液制备方法参见文献[10]。细菌冻融液与营养肉汤混合后置于水浴摇床，在 37 ℃、120 r/min 条件下扩增 10 h，扩增后使用酶标仪对光密度进行检测，估算活菌浓度达到 1 × 109个/ml 后用于试验。根据受试物溶解度，并根据抑菌情况调整后，设置 5 个给药浓度，分别在有/无 S9代谢活化条件下使用 6 孔板开展 Ames 试验。每毫升 10% S9混合液中含有0.335 ml 灭菌注射用水、0.5 ml 0.2 mol/L 磷酸氢钠缓冲液（pH 7.4）、0.04 ml 0.1 mol/L NADP 溶液、0.005 ml 1 mol/L G-6-P 溶液、0.02 ml 1.65 mol/L KCl-0.4 mol/L MgCl2溶液、0.1 ml S9溶液；每毫升 30% S9混合液中含有 0.135 ml 灭菌注射用水、0.5 ml 0.2 mol/L 磷酸氢钠缓冲液（pH 7.4）、0.04 ml 0.1 mol/L NADP 溶液、0.005 ml 1 mol/L G-6-P 溶液、0.02 ml 1.65 mol/L KCl-0.4 mol/L MgCl2溶液、0.3 ml S9溶液。进行预培养法时，将S9混合液、亚硝胺类化合物及菌种混合加入灭菌玻璃管中，置于水浴摇床中 37 ℃、120 r/min 培养1 h 后再加入琼脂铺板。平皿掺入法则直接将 S9混合液、药物、菌种和琼脂混合均匀后铺板。试验设置 DMSO 溶媒对照组，每组平行 3 孔，所有样本置于 37 ℃ 恒温培养约 48 h 后进行菌落计数，上述试验重复 3 次。

1.2.2 菌落计数及结果判定 计数每孔中的回复菌落数量，每个浓度组分别求得均值，并以±s表示。TA1535 和 TA1537 试验组平均每皿/孔中的回复菌落数大于溶媒对照组数值 3 倍，其他菌株试验组平均每皿/孔中的回复菌落数大于溶媒对照组数值 2 倍且存在量效关系时判断结果为阳性；反之为阴性。

2 结果

2.1 非代谢活化条件下的 Ames 试验结果

本研究使用 6 孔板开展基于 6 种鼠伤寒沙门氏菌的 Ames 试验。非代谢活化条件下，剂量范围为 3.125 ～ 50 μg/孔的 NDMA 和 NDEA 无明显抑菌性，且诱导的各菌回复突变菌落数与溶媒对照（0.1% DMSO）相比均未见明显增加（表1）。

表1 非代谢活化条件下 Ames 试验结果Table 1 Ames test results under non-metabolic activation conditions

2.2 不同来源 S9 对结果的影响

亚硝胺类化合物主要经 CYP2E1 代谢活化，但不同种属所表达的 CYP2E1 有所不同。本研究分别使用含量为 10% 的大鼠 S9、小鼠 S9和人 S9开展试验，并比较了平皿掺入法和预培养法处理后对结果的影响。所用浓度均为不产生明显细菌毒性作用的浓度条件（即无明显抑菌性），结果如表2 ～ 4 所示。平皿掺入法的大鼠 S9试验中NDMA 和 NDEA 可诱导 TA97 的回复突变菌落数呈剂量效应相关性的增加，但与溶媒对照组比较增加倍数未达 2 倍及以上；预培养法的大鼠S9试验中 NDMA 和 NDEA 可诱导 TA97 和TA1535 的回复突变菌落数呈剂量效应相关性的增加，且较高剂量（TA97 为 1000 μg/孔，TA1535 为500 μg/孔及以上）时与溶媒对照组比较增加倍数达2 倍以上。平皿掺入法的小鼠 S9试验中 NDMA在 TA98、TA100，NDEA 在 TA100 中与溶媒对照组的回复突变菌落相比有轻微增加，但无明显剂量相关性。预培养法的小鼠 S9试验中 NDMA 和NDEA 诱导的各菌回复突变菌落数与溶剂对照组相比未见明显增加。平皿掺入法和预培养法的人 S9试验中 NDMA 和 NDEA 诱导的各菌回复突变菌落数与溶剂对照组相比均未见明显增加。可见，经大鼠 S9预培养后，NDMA 和 NDEA 可导致更多菌株的更低浓度作用条件下的回复突变菌落数大幅增加。而经小鼠 S9和人 S9预培养后试验结果与平皿掺入法的小鼠 S9试验和人 S9试验结果没有明显差别，提示预培养对于小鼠和人 S9试验结果无明显影响。此外，当 S9含量均为 10% 且受试物作用浓度相同的情况下，仅在大鼠 S9处理后（预培养法）NDMA 和 NDEA 的细菌致突变性结果为阳性，因此认为大鼠 S9的代谢活化效果最佳。

表2 不同试验方法 10% 大鼠 S9 代谢活化后结果比较Table 2 Comparison of the results of 10% rat S9 metabolism activated by different test methods

表3 不同试验方法 10% 小鼠 S9 代谢活化后结果比较Table 3 Comparison of the results of 10% mouse S9 metabolism activation with different test methods

表4 不同试验方法 10% 人 S9 代谢活化后结果比较Table 4 Comparison of the results of 10% human S9 metabolism activated by different test methods

2.3 经大鼠 S9 代谢活化后的 Ames 试验结果

为进一步考察最优的代谢活化条件，本研究使用含量为 30% 的大鼠 S9在预培养条件下（37 ℃培养 1 h）开展试验。回复突变菌落计数结果提示（表5）当前条件下 NDMA 可诱导 TA1535 回复突变菌落数为溶媒对照组（0.1% DMSO）的 3 倍；NDEA 可诱导 TA97、TA100、TA102 和 TA1535回复突变菌落数为溶媒对照组的 2 ～ 10 倍，与使用含量为 10% 的大鼠 S9开展的试验结果进行比较出现阳性结果的菌株较多且浓度较低。由上述结果可知，NDMA 和 NDEA 的原型单体无明显致突变性，但两者的代谢活化后产物具有较强致突变性，且 NDEA 代谢产物的致突变性更强。

表5 大鼠 S9 代谢活化条件下 Ames 试验结果Table 5 Ames test results under the condition of metabolic activation of S9 in rats

3 讨论

本研究比较了有无 S9代谢活化、不同来源 S9以及预培养（增加 S9与受试物的相互作用）对Ames 试验结果的影响。研究结果首先验证了NDMA 和 NDEA 原型单体化合物无致突变性，经大鼠 S9充分代谢活化后则存在致突变性。含量为30% 的大鼠 S9代谢活化条件下，NDMA 可诱导TA1535（GC 碱基置换）突变率增加，而 NDEA 可诱导 TA97（GC 移码突变）、TA100（GC 碱基置换）、TA102（AT 碱基置换）和 TA1535（GC 碱基置换）突变率增加。当前认为，烷化剂致癌的关键代谢途径与 α-羟基化有关[11]。大多数情况下，该途径为经细胞色素 P450 酶催化后产生的 α-碳氧化作用，而由此产生的羟基化中间体（α-亚硝基氨基醇）不稳定，易于重排后形成醛和烷基重氮氢氧化物[12]。本研究的 Ames 试验中启动 I 相代谢反应，代谢活化产物的致突变性可能与发生上述反应有关。文献报道，NDMA 经代谢后可形成重氮甲烷，并进一步反应形成甲基正离子[8]。两者均可对 DNA 进行甲基化，从而导致碱基错配而发生突变。NDMA 在大鼠中的 TD50为 0.096 mg/(kg·d)，主要表现为肝、肾、肺、睾丸肿瘤；在小鼠中的 TD50为 0.189 mg/(kg·d)，主要表现为肝和脑部肿瘤[13]。NDEA 在大鼠中的 TD50为 0.0265 mg/(kg·d)，主要表现为消化道和尿道肿瘤；在灵长类动物中的TD50为 0.007 ～ 0.054 mg/(kg·d)，主要表现为肝肿瘤[14]。相同暴露条件下 NDEA 的致癌风险略高于NDMA，致癌性试验结果与 Ames 试验结果相符。

S9混合液是 Ames 试验代谢活化条件中的常用试剂，模拟受试生物体内代谢活化条件，用于考察受试物代谢产物的致突变风险。其成分为肝细胞除去细胞核、线粒体及碎片之后的部分，主要包括肝微粒体蛋白及肝细胞浆内的蛋白质[15]。试验所用SD 大鼠 S9和 CD-1 小鼠 S9均为动物经口给予苯巴比妥钠和 β-萘黄酮进行诱导后，再取动物肝脏匀浆制成。但人源的 S9在制备时未经诱导。不同种属来源的 S9中所包括的代谢酶有所差异。人类肝脏匀浆在将亚硝胺代谢成诱变剂方面与未经诱导的大鼠肝脏匀浆相似，但观察到个体间存在较大差异[16]。比较本研究结果可知大鼠 S9的代谢活化效果优于小鼠 S9和人源 S9，NDMA 的致癌试验数据也提示大鼠是其更为敏感的诱导肿瘤形成的种属。然而，Malling[17]比较了小鼠肝微粒体和大鼠肝微粒体制剂对亚硝胺类物质代谢活化的影响，发现小鼠肝微粒体通常比大鼠肝微粒体制剂更有效地激活亚硝胺成为诱变剂，与本研究结果相左。Nakajima 等[18]研究结果则提示雄性 B6C3Fl 小鼠肝脏中 CYP2El 含量高于雄性 Wistar 大鼠。故推测本研究中小鼠 S9对亚硝胺类化合物代谢能力不佳的原因可能与当前来源的小鼠 S9组分中CYP2E1 和 CYP2A6 含量较低或失活有关。此外，本研究发现 10% 的小鼠 S9和人 S9预培养法与平皿掺入法的结果差异不明显，提示对于 NDMA和 NDEA 而言小鼠 S9和人 S9的代谢活化能力有限。总之，不同种属的 S9对亚硝胺化合物的代谢活化情况主要取决于相关代谢酶含量，与所用动物品系、诱导方法、制备工艺等多重因素有关。人S9的代谢活化能力不佳也可能与 S9混合液成分配比有关，有待进一步研究。此外，市场上人 S9的价格约为大鼠 S9的 5 倍。因此，本研究结果提示使用大鼠 S9开展细菌回复突变试验效果最佳，且性价比最优。

综上，本研究证实了使用经诱导的大鼠 S9检测 N-亚硝胺类化合物致突变性的合理性。受试物与 30% 的大鼠 S9在 37 ℃ 条件下预培养 1 h后，可有效检出 N-亚硝胺类化合物的致突变性，结果较为可靠。上述方法学摸索为 N-亚硝胺类化合物及其他代谢活化后产生致突变性物质的风险评价奠定基础。