齿龈内阿米巴接种对大鼠牙周炎发生发展的影响观察

吴泽钰，王琛，侯秋莲

1 新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐830054；2 新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）牙体牙髓病科

牙周炎影响着世界上一半的成年人，表现为牙齿支持器官（包括牙周韧带和牙槽骨）的渐进性破坏，可导致牙齿脱落，并与糖尿病、心血管疾病等全身性疾病相关。牙周炎的特征是微生物动态平衡的破坏，表明口腔黏膜微生物群落与宿主上皮细胞和免疫细胞之间复杂的相互作用网络失衡［1］。齿龈内阿米巴（Entamoeba gingivalis，E. g）是已知在人类口腔中定居的内阿米巴，常常在健康的个体中被检测到。虽然E. g被认为是一种危害较小的微生物，但关于它的致病性仍存在争议，有研究［2］认为其与牙周病也有关联。许多关于E. g的生物学和遗传学特征的研究［3-4］提示，E. g在牙周病的初始阶段和进展中起促进作用。近期的研究［5］提示，E. g在牙周炎发生发展中的作用有可能被忽略，E. g在健康口腔黏膜中的定植率为15%，这种定植可以是无症状的，并且被认为是非致病性的，但E. g也可通过巨噬细胞增多症杀死活的上皮细胞，显示出很强的致病性，它还能够侵入撕裂的口腔黏膜，摄取活细胞的碎片，这表明它具有致病潜力。一项元基因组分析［6］表明，活性微生物群落的类组成多样性降低是口腔炎症部位的特征之一，而与此同时E. g却在发生炎症的牙周袋中的发现率显著增加。研究［7-8］表明，免疫抑制剂醋酸泼尼松龙干预的情况下，可实现E. g的口腔内接种，并可导致牙周炎。2021 年1 月—5 月，本研究观察了E. g接种对大鼠牙周炎发生发展的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1. 1E. g虫株、大鼠 选择2021 年1 月—2 月就诊于新疆医科大学第一附属医院（附属口腔医院）牙周科并确诊为牙周炎的成人患者，用已灭菌的牙周探针采集患者牙周袋内菌斑，将菌斑置于生理盐水中，直接涂片，镜检观察。发现有E. g者再次取牙周袋内容物，在28 ℃温箱内放置于改良的含有青霉素（500 U/mL）和链霉素（500 U/mL）的蛋白胨-酵母-葡萄糖（Peptone-yeast-glucose，PYG）培养液中，无菌纯培养4 d 至对数生长期，血细胞计数板计数原虫，调制成原虫浓度为3×104个/mL的悬液，振荡混匀备用。6～8 周龄雄性SD 大鼠24 只，由新疆医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（新）2018-0002，分笼饲养，自由进食、水，饲料为动物实验中心提供的标准大鼠饲养饲料。

1. 2 大鼠分组、牙周炎模型制备和E. g接种方法采用随机数表法将24 只大鼠随机分为对照组（C组）、齿龈内阿米巴干预组（E. g组）、实验性牙周炎组（EP组）、混合干预组（mix组），每组6只。EP组采用4-0 丝线结扎左侧上颌第一磨牙制作牙周炎模型，将结扎日期定为第0 天。C 组从第1 天开始，给予大鼠醋酸泼尼松龙1. 2 mg 肌注，共7 d；同时生理盐水0. 2 mL涂抹于大鼠左上第一磨牙龈缘，共14 d。E. g组从第1 天开始，给予大鼠醋酸泼尼松龙1. 2 mg 肌注，共7 d；同时E. g悬液0. 2 mL 涂抹于大鼠左上第一磨牙龈缘进行E. g接种，共14 d。mix组第0 天采用4-0 丝线结扎左上第一磨牙制作牙周炎模型；第1天开始，给予大鼠醋酸泼尼松龙1. 2 mg肌注，共7 d；同时E. g悬液0. 2 mL 涂抹于大鼠左上第一磨牙龈缘进行E. g接种，共14 d。

1. 3 各组大鼠体质量及左上颌第一磨牙的牙周袋探诊深度（PD）、龈沟出血指数（SBI）检测 从实验第1天开始至第14天，每日称量大鼠体质量，然后用牙周探针轻探入左上颌第一磨牙龈沟内或袋内，测量PD，取出探针30 s 后，观察有无牙龈出血及其出血量，记录SBI。

1. 4 各组大鼠左上颌第一磨牙牙槽骨吸收情况观察 实验第15 天，所有大鼠腹主动脉取血处死大鼠，获取左侧上颌骨标本，使用SCANCO Medical AG进行microCT 检查，观察各组大鼠左上颌第一磨牙牙槽骨吸收情况。

1. 5 各组大鼠左上颌第一磨牙牙周组织病理学变化观察 取各组大鼠包含牙周组织的左侧上颌骨标本，4%多聚甲醛固定24 h，冲洗后EDTA脱钙液脱钙、冲洗后再次4%多聚甲醛固定4 h，冲洗后常规脱水，石蜡包埋，5 μm切片，按照HE染色试剂盒使用说明书要求对切片进行染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察大鼠左上颌第一磨牙牙周组织病理学变化。

1. 6 各组大鼠血清中环氧合酶2（COX2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子（VEGF）检测 取各组大鼠腹主动脉血，凝血后在4 ℃条件下1 500 r/min 离心15 min，获取上层血清，按照ELISA 检测试剂盒说明书要求进行操作，检测大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF。

1. 7 统计学方法 采用SPSS20. 0 统计软件。计量资料呈正态分布时以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠体质量及左上颌第一磨牙的PD、SBI变化情况 各组大鼠体质量变化情况见图1。由图1 可见，C 组和E. g组大鼠体质量稳步增长，而EP 组与mix 组大鼠体质量均在实验后期有较明显的增长。各组大鼠左上颌第一磨牙的PD 变化情况见图2。由图2 可见，EP 组与mix 组PD 在第10～12 天左右达到高峰并趋于稳定，E. g组PD 于第6 天便达到高峰，并且数值明显小于EP 组与mix 组；另外在实验过程中，观察到E. g组在实验的第5～7 天牙龈肿胀明显，龈缘平面高于正常龈缘；C 组大鼠牙龈紧贴牙齿，无法测量PD。各组大鼠结扎牙的SBI 变化情况见图3。由图3 可见，E. g组、EP 组与mix 组大鼠左上颌第一磨牙的SBI 在前7 d 均有不断增加，后趋于稳定，并有所缓解，但EP 组与mix 组牙龈出血情况明显重于E. g组，在第14 天时，mix 组SBI 明显高于EP 组与E. g组；C 组在实验过程中牙龈紧实，SBI为0。

2. 2 各组大鼠左上颌第一磨牙牙槽骨吸收情况比较 各组大鼠左上颌第一磨牙的microCT 检查结果见图4。由图4 可见，C 组大鼠左上颌第一磨牙牙槽骨无吸收，牙周膜无增宽，EP 组、E. g组和mix 组牙周膜增宽明显，并且EP 组、mix 组均可见牙槽骨吸收，mix组较EP组牙槽骨吸收更严重。

图4 各组大鼠左上颌第一磨牙的microCT检查结果

2. 3 各组大鼠左上颌第一磨牙牙周组织病理学变化比较 各组大鼠左上颌第一磨牙牙周组织病理学检查结果见图5。由图5 可见，C 组大鼠牙龈上皮、龈沟上皮和结合上皮完整存在，上皮钉突无异常，胶原纤维排列正常且整齐，亦无炎症浸润；E. g组大鼠可见龈沟内有明显炎症浸润，有牙周袋存在，但龈沟组织较完整，而EP组与mix组大鼠牙周组织可见大面积炎症浸润，龈沟内结扎痕迹明显，有深牙周袋存在，胶原纤维排列紊乱，龈沟内上皮失去原有的形态。

2. 4 各组大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表达水平比较 各组大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表达水平比较见表1。由表1 可知，与C 组相比，E. g组大鼠血清中MMP9、IL-6、VEGF 表达水平显著升高（P均＜0. 05），EP 组、mix 组大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF 表达水平均显著升高（P均＜0. 05）；与E. g组相比，EP 组、mix 组大鼠血清中COX2 表达水平均显著升高（P均＜0. 05）；与EP 组相比，mix 组大鼠血清中IL-6 表达水平显著升高（P＜0. 05）。

表1 各组大鼠血清中COX2、MMP9、IL-6、VEGF表达水平比较（-x±s）

3 讨论

牙周炎的特征是牙齿支持器官（包括牙周韧带和牙槽骨）的渐进性破坏，导致不可逆的附着和牙槽骨丧失，是成年人牙齿脱落的主要原因，并与心血管疾病、糖尿病、癌症和慢性呼吸道疾病之间相互关系。在全球范围内，这种疾病的患病率约为11%，所以牙周炎的防治也需要我们进行多方面、多角度的研究。有研究［9-10］表明，E. g在老年患者及大学生人群中感染率均较高，口腔疾病的发生发展可能与E.g的感染存在相关性。流行病学调查显示，HBV 感染的牙周病患者中，E. g的感染率较高，其牙周炎的严重程度也高于未感染HBV 的患者［11］。阿米巴在牙髓感染中的发病率很高，并可能通过富集抗吞噬细菌而促进其毒力增强［12］。多项研究［13］显示，在广泛的重度牙周炎的牙周袋中，E. g的存在率几乎为100%，并通过大量上调炎症细胞因子从而导致中性粒细胞浸润。

本 研 究 中microCT 结 果 显 示，EP 组、E. g组和mix 组牙周膜增宽明显，另外在实验过程中，观察到E. g组在实验的第5～7 天牙龈肿胀明显，龈缘平面高于正常龈缘，并且EP组、mix组均可见牙槽骨吸收，mix组较EP组牙槽骨吸收更严重。在本研究中，与EP 组相比，mix 组大鼠血清中IL-6 表达水平显著升高，但EP组、mix组与E. g组间的差异无统计学意义，这可能是E. g存在于大鼠口腔，上调牙周炎大鼠的IL-6，作为在牙周炎急性期高表达的细胞因子，导致口腔组织持续破坏的原因。中性粒细胞在保护宿主免受微生物入侵时，可以产生包括促炎细胞因子、基质金属蛋白酶和活性氧物种上调在内的反应，所有这些都会导致与牙周炎相关的组织损伤和牙齿脱落［14］。在本研究中，EP 组、mix 组、E. g组大鼠血清中MMP9 和VEGF 的表达水平无统计学差异，但都较C 组升高，这也是导致大鼠牙周炎口腔黏膜被破坏的原因。E. g可能在牙周炎的发展中起间接作用。阿米巴有细胞质内的细菌，这些细菌可以在大的食物液泡内存活或死亡［15］。体外研究［16］表明，一种在口腔中发现的原生动物牙龈卟啉单胞菌，能够进入、存活和复制卡氏棘阿米巴。这些结果表明，阿米巴可能是这些细菌的储存库，保护它们免受免疫细胞和阿莫西林等抗菌药物的侵袭，并参与非手术治疗后牙周袋的重新定植［17］。所以口腔内原生动物的存在，对于牙周炎的影响应重新评估。

本研究中，为了解E. g是否能够侵入口腔黏膜，对各组大鼠牙周组织还进行了病理学检查，结果显示，E. g组可见龈沟内有明显炎症浸润，有牙周袋存在，但龈沟组织较完整，而EP 组与mix 组大鼠牙周组织可见大面积炎症浸润，龈沟内结扎痕迹明显，有深牙周袋存在，胶原纤维排列紊乱，龈沟内上皮失去原有的形态。BAO 等［18］对严重的全身性慢性牙周炎患者的炎症牙龈进行了显微镜分析，组织染色后观察到，在被大量中性粒细胞包围的不同组织层中观察到E. g，并通过聚合酶链式反应证实了E. g的存在，在未发炎的体外活组织标本的牙龈上皮内，显微镜分析没有发现E. g；然而，在用手术刀轻微切开牙龈上皮层或用无菌针刺穿牙龈活组织后，发现阿米巴滋养体在孵育6 h后进入活跃期和摄食期，显微镜显示阿米巴在牙龈组织内移动，穿透到活的宿主牙龈上皮细胞的细胞质中，并摄取宿主细胞核中的碎片，而在未损伤的牙龈中，孵育6 h 后未见阿米巴侵入。RAFAEL 等［19］分别于诱导SD 大鼠实验性牙周炎后的第1、3、5、7、14、21 天处死动物，实验得出结论，结扎诱导的大鼠实验性牙周炎模型表现为两个不同阶段的进行性牙槽骨吸收：急性期（第1～14天）以炎症和快速骨吸收为特征；慢性期（第14～21天）骨丢失无明显进展。这些与本研究的结果相似，E. g组大鼠无论从临床指标，或是血清中COX-2 水平均低于EP组及mix组。

目前，机械刮治及洁治是治疗牙周炎的主要手段，使用硝基咪唑类抗菌药物如甲硝唑，是机械治疗的辅助手段。使用甲硝唑治疗原虫口腔感染时，成人常规推荐剂量为每天3 次，每次400 mg，为期1周，当患者存在免疫缺陷或合并有其他部位感染等情况时，药量和用药时间应适当增加。MOROZ等［20］通过体外实验验证，在14 种漱口液中，洗必泰在清除原虫方面也有高效作用。

综上所述，E. g接种可促进大鼠牙周炎的发生发展，表现为牙龈肿胀、牙槽骨吸收、牙龈炎症浸润等症状，且血清中COX2、IL-6等表达水平升高，表明它具有一定的致病潜力，提示在治疗牙周炎的过程中应考虑E. g在口腔的感染情况。本研究提示E. g在口腔感染性疾病中的作用可能被低估，为牙周炎的预防及治疗提供了新的思路。