羟基红花黄色素A 腹腔注射对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制

王飞，乔栎，刘建雄，张宏星

1 甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州730030；2 甘肃省人民医院神经外科

缺血性脑卒中是危害人类健康的常见疾病之一，其致残率及致死率较高。羟基红花黄色素A（hydroxysafflor yellow A，HYSA）是从红花的主要成分红花黄色素中提取的含量最高的单体，极性较强，是治疗缺血性疾病疗效显著的中草药。研究［1-4］发现，HYSA 在心肌缺血再灌注损伤、抗癌、抗凝血方面具有良好的治疗作用。2005 年，HYSA 被国家食品药品监督管理局批准用于急性心肌梗死、冠心病、心绞痛等心脏病患者的治疗。研究［5］发现，银杏叶中提取的银杏素可以减少脑缺血再灌注损伤大鼠的凋亡细胞数量，其可通过下调Caspase-3 和Bax 的水平以及上调Bcl-2 的水平抑制大鼠细胞凋亡来拮抗脑缺血再灌注的损伤。研究［6］发现，大鼠脑缺血区域c-fos 基因表达升高可通过减少细胞凋亡，从而改善大鼠脑缺血后的功能。丁苯酞的主要化学成分是3-丁基-1（3H）-异苯并呋喃酮，在中国已被批准用于治疗缺血性脑卒中，疗效确切。研究［7］发现，丁苯酞可上调Bcl-2 蛋白表达和下调Bax、Caspase-3 蛋白表达，通过抗凋亡机制对脑缺血再灌注损伤起显著的神经保护作用。2021年1—9月，我们观察了腹腔注射对大鼠脑缺血再灌注损伤的预防作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1. 1 大鼠、药品、试剂及仪器 SPF 清洁级雄性SD大鼠60只购自甘肃中医药大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（甘）2020-0001，动物质量合格证号：NO. 62001000000584，体质量250～280 g，饲养在清洁、安静、通风良好的环境中，自由进食、饮水。实验大鼠经甘肃中医药大学机构动物护理和使用委员会批准。丁苯酞软胶囊（0. 1 g/粒）购自甘肃省人民医院药剂科。羟基红花黄色素A，批号：34512，分析标准品≥98%。Bax 抗体、Bcl-2 抗体、Caspase-3 抗体和c-fos 抗体抗体均购自美国Immunoway 公司。JB-P5 包埋机购自俊杰电子有限公司，RM2016 病理切片机购自上海莱卡仪器有限公司，BX53 奥林巴斯显微拍照系统购自OLYMPUS 公司，Western blotting 仪器全套购自伯乐生物科技公司，MiniChemi 610 化学发光成像仪购自北京六一生物科技有限公司，Quantstudio 3 荧光定量PCR 仪购自Thermofisher 公司，ABI-9700PCR 扩增仪购自Applied biosystems 公司，11141-C 反转录试剂盒购自上海翊圣公司。

1. 2 大鼠分组、HYSA 腹腔注射及脑缺血再灌注处理方法 60 只SD 大鼠随机分成假手术组、模型组、丁苯酞组、低剂量HYSA 组、高剂量HYSA 组，每组12 只。假手术组、模型组给予腹腔注射0. 9% NaCl溶液，剂量为1. 0 mL/kg；丁苯酞组给予腹腔注射丁苯酞软胶囊混悬液（0. 1 g 丁苯酞软胶囊溶解于100 mL tween80 溶液中，浓度为1 mg/mL），剂量为80 mg/kg；低剂量HYSA组给予腹腔注射5. 0 mg/mL的HYSA，剂量为1. 0 mL/kg；高剂量HYSA 组给予腹腔注射10. 0 mg/mL 的HYSA，剂量为1. 0 mL/kg；大鼠均腹腔注射每天1 次，连续5 d。各组大鼠腹腔注射5 d 后，模型组、丁苯酞组、低剂量HYSA 组、高剂量HYSA 组参照文献［8-9］使用小修正方法进行脑缺血再灌注处理，假手术组不插线栓，其余过程相同。

1. 3 各组大鼠神经功能评分 各组大鼠处理完毕后清醒4 h，采用Longa 评分法对各组大鼠进行神经功能评分。无神经功能损伤记0 分，不能完全伸展对侧前爪记1 分，向对侧转圈记2 分，向对侧倾倒记3分，不能自发行走或意识丧失记4分。

1. 4 各组大鼠脑组织形态学观察 采用HE 染色法。处理完毕后，每组取5 只大鼠，采用5% 水合氯醛麻醉，快速开胸，用4% 多聚甲醛200 mL心脏灌注后，断头取脑，取缺血部位脑组织置于4% 多聚甲醛液中固定，由低浓度到高浓度乙醇梯度脱水1 h，二甲苯透明20 min，浸蜡后包埋组织，蜡块室温冷却后以4 μm 厚度切片，37 ℃烘干切片后，二甲苯脱蜡，高浓度到低浓度乙醇脱水并水洗，苏木精染色，盐酸酒精分化，伊红染色，高浓度乙醇脱水，二甲苯浸泡5 min，中性树胶封片，在光学显微镜下观察脑组织形态学变化。

1. 5 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 检测 采用RT-qPCR 法。处理完毕后，每组取7 只大鼠，5% 水合氯醛麻醉，断头法处死，取缺血再灌注区皮层组织，置于-80 ℃冰箱里保存。取缺血再灌注区皮层组织，研磨、匀浆，按TRLzol 法常规提取组织总RNA，反转录为cDNA，PCR 扩增。Bax 引 物 上 游 序 列 为 5′-GAACCATCATGGGAAAGGACA-3′，下 游 序 列 为5′-GGTCCATCATGGAAAGGA-3′；Bcl-2 引 物 上 游 序 列 为5′-CCAGCATGCGACCTCTGTTT-3′，下 游 序 列 为5′-CTCACTTGTGGCCCAGGTAT-3′；Caspase-3 引 物上 游 序 列 为5′-GAGCTTGGAACGCGAAGAAA-3′，下游序列为5′-GAGTCCATCGACTTGCTTCCA-3′；c-fos 引物上游序列为5′-CGGGTTTCAACGCGGACTAC-3′，下游序列为5′-GTTGGCACTAGAGACGGACAGA-3′；GAPDH 引物上游序列为5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列为5′-ACGCCAG-TAGACTCCACGACAT-3′。扩增产物采用凝胶成像分析系统进行扫描、分析，以GAPDH 为参照，以2-ΔΔCt表示脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 的相对表达量。

1. 6 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白检测 采用Western Blotting 法。取梗死区周边脑组织，以组织裂解液提取组织蛋白，4 ℃条件下以12 000 r/min 离心15 min 后收集上清液，以BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白含量。取蛋白30 μg，与上样缓冲液混合后，行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳，并于电泳后转移至硝酸纤维素酶膜上，以5% 脱脂牛奶室温封闭2 h，加入Bax（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）和c-fos（1∶1 000）抗体一抗和内参GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育过夜；用TBST 溶液清洗10 min，清洗3次，加入抗兔IgG 二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，用TBST 溶液清洗10 min，清洗3 次，以ECL 化学发光试剂显色后置于蛋白电泳系统及凝胶成像仪上成像，使用Image J 软件处理，以目的蛋白与内参GAPDH 条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1. 7 统计学方法 采用SPSS25. 0 统计软件。计量资料呈正态分布时以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。P＜0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组大鼠神经功能评分比较 假手术组、模型组、丁苯酞组、低剂量HYSA 组、高剂量HYSA 组大鼠神经功能评分分别为0、（2. 75 ± 0. 50）、（1. 75 ±0. 50）、（2. 00 ± 0. 81）、（1. 75 ± 0. 50）分，其中假手术组大鼠神经功能未受损，模型组大鼠神经功能评分显著高于其余各组（P均＜0. 05），高剂量HYSA组、丁苯酞组大鼠神经功能评分显著低于低剂量HYSA组（P均＜0. 05）。

2. 2 各组大鼠脑组织形态学变化 各组大鼠脑组织形态学变化见图1。由图1可见，假手术组大鼠脑组织结构无异常，细胞结构完整，细胞核形态正常，染色质均匀；模型组大鼠脑组织细胞间隙明显增大，细胞核减少且深染，细胞形态不规则；低剂量HYSA组较模型组细胞形态有一定改善，但部分细胞核仍浓缩深染；高剂量HYSA 组和丁苯酞组与模型组相比，细胞坏死明显改善，细胞形态恢复正常，细胞排列整齐。

2. 3 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA 的相对表达量比较 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos mRNA的相对表达量比较见表1。由表1 可知，模型组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 的相对表达量显著高于其余各组（P均＜0. 05），Bcl-2 mRNA的相对表达量显著低于其余各组（P均＜0. 05）；高剂量HYSA组、丁苯酞组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 的相对表达量显著低于低剂量HYSA 组（P均＜0. 05），Bcl-2 mRNA 的相对表达量显著高于低剂量HYSA组（P均＜0. 05）。

表1 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-os mRNA的相对表达量比较（-x±s）

2. 4 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白相对表达量比较 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白的相对表达量比较见表2。由表2可知，模型组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3、c-fos蛋白的相对表达量显著高于其余各组（P均＜0. 05），Bcl-2 蛋白的相对表达量显著低于其余各组（P均＜0. 05）；高剂量HYSA 组、丁苯酞组大鼠脑组织中Bax、Caspase-3、c-fos 蛋白的相对表达量显著低于低剂量HYSA 组（P均＜0. 05），Bcl-2 蛋白的相对表达量显著高于低剂量HYSA 组（P均＜0. 05）。

表2 各组大鼠脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos蛋白的相对表达量比较（-x±s）

3 讨论

脑卒中被认为是导致死亡和神经功能障碍的主要原因，病理生理机制复杂，其中凋亡和自噬在脑缺血中扮演着重要的作用［10］。缺血性脑卒中一旦发生会使暗带区的自噬和凋亡激活［11］，且近期研究发现自噬和凋亡在大鼠脑缺血再灌注后12 h 被激活，在亚急性期存在凋亡到自噬的状态转换［12］，因此通过干预脑缺血再灌注损伤时细胞凋亡可对脑神经起保护作用，从而阻止发生缺血性脑卒中后神经功能障碍。Bax是促凋亡基因，Bcl-2位于线粒体外膜，通过抑制内源性途径阻止细胞凋亡抗凋亡基因，在外界不同因素的刺激下，这两种蛋白通过细胞内线粒体蛋白释放，共同作用于细胞的凋亡过程［13］。Caspase-3 参与细胞凋亡程序，抗凋亡因子Bcl-2 蛋白表达增加和促凋亡因子Bax 蛋白表达减少可激活Caspase-3 凋亡信号通路［14］。c-fos 基因的启动子区域有与Jun 通过亮氨酸拉链结合成异源二聚体AP-复合体的AP-1结构，可调节细胞凋亡［15］。

HYSA 是治疗缺血性疾病疗效显著的中草药，HYSA 对心脑血管疾病的治疗作用主要在于其通过作用于复杂的信号通路而发挥抗氧化、抗炎和神经保护作用［16］。研究［17］显示，HYSA 治疗心脏缺血再灌注损伤时，可通过减少Caspase-3蛋白的表达及降低促凋亡蛋白Bax 的表达对心脏细胞起保护作用，且HYSA 还有抗脑缺血的功效。研究［18］发现，HYSA通过抑制线粒体通透性过渡孔的凋亡来减轻脑缺血再灌注损伤。目前对于HYSA 对于抗脑缺血的研究暂无明确机制，本文通过探究HYSA 对凋亡过程中Caspase-3、Bax、Bcl-2、c-fos 的影响，为临床上HYSA治疗脑缺血再灌注损伤提供更多的理论基础。

研究［19-20］发现，丁苯酞目前在临床上治疗脑缺血再灌注方面效果确切，在脑缺血再灌注损伤方面主要通过减少Caspase-3 mRNA 的表达起保护作用，丁苯酞还可通过抑制c-Jun N 端激酶（JNK）-Caspase3信号通路起作用，故本研究采用丁苯酞作为阳性药物对照组。本研究通过构建大鼠脑缺血再灌注损伤模型，并在构造模型前腹腔注射HYSA，结果表明，神经功能评分方面，高剂量HYSA 组与丁苯酞组无统计学差异（P＞0. 05），与模型组相比有统计学差异（P＜0. 05），说明高剂量HYSA 在治疗缺血性脑卒中和丁苯酞疗效相当，同样可以对脑缺血再灌注起预防作用。在大鼠脑组织形态学变化方面可见，高剂量HYSA 组和丁苯酞组与模型组相比，细胞坏死明显改善，细胞形态恢复正常，亦说明HYSA 对脑缺血再灌注损伤后神经细胞起预防作用。在模型组中，大鼠缺血灌注损伤可以上调Bax、Caspase-3、cfos mRNA 和蛋白表达，而下调Bcl-2 mRNA 和蛋白的表达；与模型组相比，通过腹腔注射HYSA 和丁苯酞均可以下调Bax、Caspase-3 和c-fos mRNA 和蛋白表达，上调Bcl-2 mRNA 和蛋白表达，因此HYSA 可能通过下调Bax、Caspase-3、c-fos mRNA 和蛋白表达和上调Bcl-2 mRNA 和蛋白表达从而减轻细胞凋亡；丁苯酞组与高剂量HYSA 组下调Bax、Caspase-3 和c-fos mRNA 和蛋白表达和上调Bcl-2 mRNA 和蛋白表达无明显统计学差异（P均＞0. 05），因此临床上治疗缺血性脑卒中高剂量HYSA 和丁苯酞的疗效可能相当，当然其机制是否相同这有待进一步研究。

综上所述，高剂量（10. 0 mg/mL）HYSA 腹腔注射对大鼠脑缺血再灌注损伤有预防作用，与丁苯酞效果相当；HYSA 预防大鼠脑缺血再灌注损伤的作用机制可能与调节脑组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、c-fos的表达有关。本研究揭示了HYSA 对脑缺血再灌注的预防机制作用，可以为缺血性脑卒中的临床治疗提供新的实验支持和理论依据。