金郁欢汤剂灌胃对抑郁症小鼠抑郁样行为的改善作用及其机制

刘宏，赵莉，张雨薇，仲丽丽，代巧妹，杨婧，李冀

1 黑龙江中医药大学基础医学院，哈尔滨150040；2 黑龙江中医药大学研究生学院；3 黑龙江中医药大学第一附属医院

抑郁症是一种常见的情感性精神障碍，它的主要临床特征是持续抑郁、悲观、对周围环境缺乏兴趣、睡眠障碍、精神和认知延迟，甚至有自杀倾向［1］。西药治疗抑郁症主要用以氟西汀为代表的5羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂等，其可选择性地抑制5-HT转运体，阻断突触前膜对5-HT 的再摄取，延长和增加5-HT 的作用，从而产生抗抑郁作用。但越来越多的证据［2］表明，应用氟西汀治疗抑郁症可能会产生头晕、震颤、认知障碍、尿潴留和性功能障碍等不良反应。抑郁症在中医学被称为“郁证”，越来越多的研究［3-4］表明，中药及其复方制剂在治疗抑郁症方面显示出独特的疗效。中药制剂不仅不良反应少，而且疗效可与化学药物媲美，患者容易接受此类治疗［5-6］。研究［7］发现，慢性应激可以导致抑郁症动物模型大脑海马区的神经细胞凋亡率上升，神经细胞数量显著减少。本课题组前期对乌腺金丝桃单味药的作用及其作用机理进行了相关研究，证明乌腺金丝桃可改善慢性温和不可预见性刺激（Chronic mild unpredictability stress，CMUS）大鼠的抑郁样表现［8-9］。中药金郁欢由乌腺金丝桃、郁金、合欢花三味中药组成。其中乌腺金丝桃味苦性平，具清热解毒、凉血止痛之功；郁金辛苦性寒，行气解郁、凉血清心；合欢花味甘性平，安神解郁，三药相伍，共奏清热凉血、解郁安神之功。基于中医对抑郁症的认识，2017 年1 月15 日—2019 年12 月24 日，我们利用CMUS 法［10］建立小鼠抑郁模型，观察了金郁欢汤剂灌胃对抑郁症小鼠抑郁样行为的改善作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1. 1 小鼠、仪器、金郁欢汤剂制备 清洁级ICR 小鼠60只，体质量（20 ± 2）g，鼠龄8～10周，雌雄不限。正常昼夜节律条件下饲养一周，自由进食和饮水。R138 轮转式切片机购自湖北泰维科技实业有限公司，JD-801 形态学图像分析系统购自捷达南京公司，PowerPacTMHC 电泳仪购自Bio-rad公司，VE-180垂直电泳槽购自天能公司，DY-B1 脱色摇床购自上海青浦沪西仪器有限公司。金郁欢汤剂：取单味药乌腺金丝桃60 g、单味药郁金30 g、单味药合欢花30 g，乌腺金丝桃与郁金、合欢花配伍比例为2∶1∶1，用水浸泡药材2h，以药材10 倍量的水进行提取。盐酸氟西汀（百忧解）购自美国礼来制药公司，在0. 5%羧甲基纤维素钠水溶液中溶解成混合悬浮。

1. 2 抑郁症模型小鼠的制备、分组及金郁欢汤剂给予方法 将60只ICR小鼠随机分为control组、model组、JYH-L 组（金郁欢低剂量）、JYH-H 组（金郁欢高剂量）、fluoxetine 组（氟西汀），每组12只，其中model组、JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine 组通过CMUS 法建立小鼠抑郁症模型。CMUS法包括9种刺激方法，每天随机选择1种刺激，每天刺激的方法不同，连续4 周。具体刺激方法如下：①用水将垫料浸湿，使鼠笼潮湿24 h；②在4 ℃冰水中游泳3 min；③在56 ℃热水中游泳3 min；④电击小鼠足部10 s；⑤将小鼠放入一个通气的透明瓶中禁锢其活动，时间2 h；⑥禁食24 h；⑦倾斜鼠笼24 h；⑧禁水24 h；⑨用活页夹夹尾2 min。造模完成后开始给药，JYH-L 组小鼠给予金郁欢汤剂灌胃，金郁欢提取物剂量为0. 2 g/kg；JYH-H 组小鼠给予金郁欢汤剂灌胃，金郁欢提取物剂量为0. 8 g/kg；fluoxetine 组小鼠给予氟西汀悬浮液灌胃，氟西汀剂量0. 02 g/kg；control 组和model 组小鼠同期等体积生理盐水灌胃；每日灌胃1次，连续3周。

1. 3 各组小鼠抑郁样行为观察 采用糖水偏嗜实验观察小鼠抑郁样行为，以糖水偏嗜度表示。实验前对各组小鼠进行蔗糖摄入训练：第1天，每只小鼠在单独的笼子里喂养，并可以自由取水，提供两瓶10% 蔗糖水，每瓶20 mL；第2天，将其中一个蔗糖水替换为一瓶20 mL 纯净水，水放在相同的容器里。蔗糖摄入训练后，小鼠禁水24 h。第4 天开始糖水偏嗜实验：2 瓶包含20 mL 蔗糖水和20 mL 纯净水被放置在笼子里（每个瓶子的总重量测量前测试）。2 h 后，再次测量每瓶的重量（动物的饮用量），并计算各组小鼠糖水偏嗜度。糖水偏嗜度=蔗糖水饮用重量/（蔗糖水饮用重量+ 纯净水饮用重量）×100%。1. 4 各组小鼠脑组织海马区神经细胞形态、尼氏小体染色观察及海马CA1 区尼氏小体积分光密度（IOD）检测 ①采用Nissl染色法观察小鼠海马区神经细胞形态、尼氏小体染色情况。每组取6只小鼠，10%水合氯醛溶液深麻醉后处死，获取小鼠脑组织，PBS 冲洗后用500 mL 的4% 多聚甲醛溶液固定，在视神经交叉后4 mm 处，即海马平面做冠状切片，大小1. 5 cm×1 cm×5 cm，4 ℃低温固定48 h，石蜡包埋并5 mm切片，浸入1% 甲苯胺蓝溶液中染色20 min，用蒸馏水快速冲洗并分化，苏木精复染，脱水后清洗并安装载玻片，光镜下观察海马区神经细胞形态、尼氏小体染色情况。②每组取1 张脑组织切片，每张切片选取10个不重叠连续高倍（×400）视野观察，使用JD-801 形态学图像分析系统检测各组小鼠海马CA1区尼氏小体IOD。

1. 5 各组小鼠海马组织中散乱蛋白1（Dvl1）mRNA和蛋白检测 ①采用实时荧光定量PCR 法检测各组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA。取小鼠海马组织标本，采用TRIzol-A + 试剂提取总RNA，逆转录为cDNA，以cDNA 为模板、以GAPDH 为内参，进行PCR扩增。Dvl1 mRNA 上游引物为5′-ATGAGGAGGACAATACGAGCC-3′，下 游 引 物 为5′-GCATTTGTGCTTCCGAACTAGC-3′。以2-ΔΔCt表 示 小 鼠 海 马 组织中Dvl1 mRNA 的相对表达量。②采用Western Blotting 法检测各组小鼠海马组织中Dvl1 蛋白。取小鼠海马组织标本，称重后在冰上用高速搅拌器匀浆，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，收集上层清液，使用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行定量。将蛋白转移到聚乙二烯二氟化物薄膜（PVDF），5%脱脂奶粉封闭1 h，加特异性抗体孵育，4 ℃过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 添加后在室温下孵化2 h，加入ECL 液，以GAPDH 为内参，用Image J 软件进行图像处理后计算小鼠海马组织中Dvl1 蛋白的相对表达量。

1. 6 统计学方法 采用SPSS19. 0 统计软件。计量资料呈正态分布时以-x±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用Bonferroni，s法。P＜0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 各组小鼠抑郁样行为比较 control 组小鼠糖水偏嗜度为4. 12% ± 0. 95%，model组小鼠糖水偏嗜度为2. 21% ± 0. 47%，两组相比，P＜0. 05。 model组、JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠糖水偏嗜度 分 别 为2. 21% ± 0. 47%、2. 60% ± 0. 59%、3. 70% ± 0. 42%、4. 00% ± 0. 36%，其中JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠糖水偏嗜度与model 组相比，P均＜0. 05；JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠糖水偏嗜度与JYH-L组相比，P均＜0. 05。

2. 2 各组小鼠海马区神经细胞形态、尼氏小体染色情况及海马CA1区尼氏小体IOD值比较 各组小鼠海马区神经细胞形态、尼氏小体染色情况见图1。由图1 可见，与control 组相比，model 组神经细胞排列松散或缺失，尼氏小体被轻微染色，甚至被溶解；与model组相比，JYH-L组神经细胞形态及尼氏小体染色上无显著差别；与model 组相比，JYH-H 组与fluoxetine 组海马区神经元细胞排列的更密集、更整齐，神经细胞无核固缩深染现象，尼氏小体染色加深。control 组小鼠海马CA1 区尼氏小体IOD 值为8 215. 96 ± 903. 58，model 组为3 025. 16 ± 898. 24，两组相比，P＜0. 05。model 组、JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine组小鼠海马CA1区尼氏小体IOD值分别为3 025. 16 ± 898. 24、3 235. 28 ± 531. 11、6 915. 12 ±1 002. 36、7 238. 46 ± 1 302. 14，其 中JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠海马CA1 区尼氏小体IOD 值与model组、JYH-L组相比，P均＜0. 05。

2. 3 各组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA 和蛋白相对表达量比较 control组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA相对表达量为2. 02 ± 0. 11，model组为0. 97 ± 0. 04，两组相比，P＜0. 05。model 组、JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA 相对表达量分别为0. 97 ± 0. 04、1. 06 ± 0. 03、1. 75 ± 0. 05、1. 75 ± 0. 11，其中JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA 相对表达量与model 组、JYH-L组相比，P均＜0. 05。

control组小鼠海马组织中Dvl1蛋白相对表达量为1. 195 9 ± 0. 091 2，model组为0. 655 4 ± 0. 038 6，两组相比，P＜0. 05。model 组、JYH-L 组、JYH-H 组、fluoxetine 组小鼠海马组织中Dvl1 蛋白相对表达量分 别 为0. 655 4 ± 0. 038 6、0. 771 4 ± 0. 082 6、1. 146 8 ± 0. 069 8、1. 560 7 ± 0. 059 5，其中JYH-H组、fluoxetine 组小鼠海马组织中Dvl1 蛋白相对表达量与model组、JYH-L组相比，P均＜0. 05。

讨论

抑郁症是一种复杂的疾病，影响某些神经系统组成部分［11］。经典的单胺类神经递质假说认为，抑郁症的发生主要与中枢神经系统5-HT、多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（A）的减少有关［12］。DVL1 是一种75 kD 的多结构域蛋白［13］，通过特定的蛋白质结构域介导典型和非典型Wnt 信号［14］。Wnt/β-catenin 通路，是目前研究较深入的途径［15］。DVL1蛋白是Wnt信号通路的中心介体，它的典型作用是在细胞质中促进β-catenin 的稳定［16］。有研究［17］发现，抑郁小鼠DVL 水平下调，而且在死后抑郁症患者的N-乙酰-L-半胱氨酸中也得到了证实。西医抗抑郁药物疗效不佳且不良反应大［18］，常见的不良反应包括戒断反应、性功能障碍和体质量增加［19］、情绪麻木、睡眠相关运动障碍、震颤和异常出血［20］等，为了使抑郁患者得到更好的疗效，我们做了对中药金郁欢的初步研究。

目前药物治疗是治疗抑郁症的主要方法［21］。传统的单一靶点抗抑郁药物疗效不理想，中医药一直被用来治疗抑郁症［22］。传统中医药理论对抑郁症具有独特的认识和较完整的治疗体系，与现代医学诊疗手段相结合，在抑郁症的治疗领域中可发挥一定的优势。药理研究［23］发现，乌腺金丝桃可用于治疗抑郁症。有研究［24］认为，合欢花具有镇静催眠作用。对抗抑郁中药处方进行药物筛选发现，郁金是抗抑郁处方的核心药物之一［25］。本研究将乌腺金丝桃、郁金、合欢花、三药合用，取名金郁欢，希望可以增强疗效。

为了研究金郁欢的抗抑郁作用，本研究采用CMUS 法建立小鼠抑郁症模型，用金郁欢对小鼠抑郁症模型进行干预，通过Nissl染色观察小鼠海马组织损伤程度，进而观察金郁欢汤剂的治疗作用。本研究结果显示，与control 组相比，model 组小鼠糖水偏嗜度显著下降；与model 组相比，JYH-L 组、JYH-H组糖水偏嗜度显著增加，说明金郁欢对抑郁小鼠有一定的治疗作用。Nissl 染色结果显示，model 组神经细胞在海马CA1 区排列松散或缺失。海马是产生应激反应的重要区域［26］，这一组织损伤是抑郁症的发病机制之一［27］。有研究［28］表明，抗抑郁药的治疗可以改善海马结构的损伤。本研究也表明JYH-L组神经细胞形态及尼氏小体染色上无显著差别，但JYH-H组海马区神经元细胞排列的更密集、更整齐，说明了金郁欢可以改善抑郁小鼠的海马结构。Western Blotting 法、RT-PCR 法检测都显示，model 组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA 和蛋白相对表达量都明显下降，而JYH-H 组小鼠海马组织中Dvl1 mRNA和蛋白相对表达量明显升高，小鼠抑郁行为显著改善。

综上，金郁欢可以提高抑郁动物模型的糖水偏嗜度，保护小鼠海马组织，发挥了抗抑郁的功效，其中低剂量金郁欢效果不明显，高剂量效果显著，我们推荐剂量为高剂量。金郁欢的这种功效可能通过多种途径实现，调节DVL1 的表达可能是其机制之一，进一步的机制有待研究。