2型糖尿病和糖尿病肾病患者肠道菌群失衡模式及功能变化的研究

冯真真，钱 磊，赵 琳，霍剑锋，倪 军

中国人民解放军陆军第八十三集团军医院 1.检验科；2.血液内分泌科，河南 新乡 453000

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是临床比较常见的内分泌失调疾病，在疾病的发展过程中会出现各种不同程度的并发症，糖尿病肾病(diabetic kidney disease，DKD)则是其中的一种。在国外的研究中发现[1]，T2DM患者普遍存在肠道菌群失衡的问题，且肠道菌群失衡模式主要表现为优杆菌属和产丁酸菌、罗斯菌的降低。我国在针对此情况调查时也发现了T2DM存在肠道菌群失衡的问题，但其失衡模式主要表现为产丁酸盐细菌的下降和机会致病菌的上升[2]。相关研究指出，T2DM患者出现肠道菌群改变后出现了慢性炎症的症状，进而导致DKD的发生。DKD的发生率可达30%，比例相对较高，其患病后的生存周期仅为10年左右[3]。从相关研究中可发现，肠道菌群产物可通过肾素-血管紧张素系统对肾脏功能产生影响[4]，并且DKD患者也出现了产短链脂肪酸细菌减少的情况。虽然T2DM患者和DKD患者均会出现菌群失调的情况，但其失衡程度以及相关性却尚不清晰，因此，我们在本文中对T2DM和DKD患者进行了研究，并针对二者的肠道菌群失衡状态以及功能的变化进行分析，具体研究报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料将2018年9月至2019年10月我院收治的T2DM和DKD患者作为研究对象，每组均纳入30例，并设定其为T2DM组和DKD组，同时选取健康体检者作为对照组，同样纳入30名。T2DM组患者年龄(61.5±2.6)岁(56～67岁)，男12例，女18例。DKD组患者年龄(62.3±2.8)岁(56～68岁)，男15例，女15例。对照组年龄(63.2±2.1)岁(56～70岁)，男15名，女15名。三组的一般资料相比，差异无统计学意义(P>0.05)，可进行组间对比。本研究获得医院伦理委员会的审批(审批号：83YY2022001LLSP)。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集和处理：选用标本为新鲜粪便标本和血清标本。血清标本中的静脉血白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的检测方法为化学发光法，C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的检测方法为免疫比浊法[5]。血液标本采集样本量为3 ml，将其使用无抗凝剂采血管保存，并以相对离心力1 000×g进行离心，离心时间为10 min，将血清成功分离后保存于冰箱内，环境为-80 ℃。粪便标本的采集：T2DM组和DKD组患者在入院后的48 h内采集新鲜粪便标本，对照组则在体检当天进行鲜粪便标本的采集。粪便标本处理方法[5]：取粪便的中心部分5～10 g，将其放入无菌EP管内进行保存，保存环境为-80 ℃。实验应用试剂盒均由恒瑞生物有限公司提供，操作时按照试剂盒使用说明书进行。

1.2.2 16S rDNA-V4区DNA扩增及测序：模板为粪便提取DNA，按照Qiagen试剂盒说明书(QiaAmp DNA Stool Mini Kit)，通过PCR对菌16S rDNA-V4可变区进行扩增[6]。扩增体系为20 μl，模板为2 μl。操作步骤：94 ℃进行预变性，时间为2 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行30个循环，最后72 ℃延伸10 min，将其保存在10 ℃环境下。反应结束后，将纯化物统一收集，按照操作样品制备试剂盒(IlluminaTruseqTMDNA)说明书操作进行测序准备，测序平台为Illumina高通量测序平台，根据其质量检验标准对比测定结果，如果实验结果出现以下菌门为主则代表实验质量较好，具体为拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和厚壁菌门。

1.2.3 血清学指标检测：使用Roche E601仪器和配套试剂检测IL-6水平，使用SIEMENS BNP仪器和配套试剂检测CRP。检测时将质量控制在允许误差范围内。

1.2.4 数据处理和菌群结构分析：数据进行原始序列处理[QIIME(v1.9.1)]，将处理后的数据与Greengenes(v13_8)数据库进行对照[7]，分析菌群结构的多样性。菌群α多样性分析：应用PD_whole_tree分析。采用LEfSe对三组中差异有统计学意义的肠道菌群进行比较。肠道菌群功能测定分析：采用PICRUSt宏基因组进行16S rRNA的基因序列测定，观察基因组功能[8]。将其与京都基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)和京都基因数据库进行对比[9]，并进行统计学分析。

2 结果

2.1 三组在门水平上菌群构成情况三组肠道主要菌群构成均为正常生理构成，但疣微菌门和梭杆菌门所占比例相对较低(见表1)。

表1 三组在门水平上菌群构成情况Tab 1 The composition of the flora at the phylum level in the 3 groups

2.2 T2DM组和DKD组患者肠道菌群α多样性肠道菌群α多样性对比显示对照组较高，T2DM组和DKD组较低，差异有统计学意义(P<0.05)；T2DM组与DKD组之间肠道菌群的α多样性比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图1A、1B和1C)。使用PCoA对三组之间以及T2DM组和DKD组的β多样性变化进行评价，图1D、1E和1F中的每个点代表了一个样品，点与点之间距离代表不同的菌群结构，以肠道菌群是否出现偏差作为统计学意义标准，结果显示，三组之间的肠道菌群差异出现了偏差，差异有统计学意义(P<0.05)，但T2DM组与DKD组之间则未出现偏差，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：A～C图为α多样性，D～F图为β多样性。

2.3 T2DM与DKD患者肠道菌群一致的变化信号与疾病特异性失衡模式使用LEfSe对T2DM组、DKD组、对照组之间的肠道菌群变化特征进行分析(见图2)。T2DM组与DKD组变化存在大部分一致的情况(P<0.05)，共同特点为产丁酸菌数量的降低，同时两组均出现了肠道菌群失衡模式，但T2DM以拟杆菌属增多为主要特点，DKD组则以乳杆菌属、史雷克菌属、厌氧棒状菌属和肠球菌属增多为主要特点。从门上来看，T2DM组和DKD组的蓝藻细菌门和厚壁菌门明显减少，从属上看，主要表现为丁酸菌丰度下降，比较明显的包括以下4种：① 柔嫩梭菌属；② 粪球菌属；③ 毛螺旋菌属；④ 罗斯菌属，以上4种菌属在T2DM患者和DKD患者的肠道中数量明显降低(P<0.05)。从变化信号上来看，虽然T2DM组和DKD组存在一定的一致性，但二者同时也存在一定的特异性，其中T2DM组特点为以下菌增加：① 拟杆菌属；② 动球菌科；③ 明串珠菌科；④ 拟杆菌科；⑤ 梭菌科，同时奇异菌属和多尔氏菌属则体现为明显下降(P<0.05)。DKD组患者的菌群失调模式特点如下：以下菌属和科明显增多，属水平：① 发酵乳杆菌属；② 嗜血杆菌属；③ 史雷克氏菌属；④ 厌氧棍状菌属；⑤ 肠球菌属；科水平：① 红蝽菌科；② 肠球菌科；③ 互养菌科；④ 韦荣菌科；⑤ 乳杆菌科，差异有统计学意义(P<0.05)；门水平：DKD患者中互养菌门显著增多(P<0.05)(见图2)。

2.4 T2DM组和DKD组患者肠道菌群功能变化通过PICRUSt对T2DM组和DKD组肠道菌群功能进行预测，并与KEGG数据库比对后发现，相对于对照组来讲，T2DM组和DKD组呈明显的一致性，尤其肠道中一些菌群的功能显著增强(P<0.05)，例如萘降解、链霉素生物合成、核苷糖代谢、氨基糖代谢、谷胱甘肽代谢以及蛋白质折叠。在一些功能上则呈显著降低，具体包括：① 甘油磷酸酯代谢；② 细菌趋药性；③ 信号传导机制；④ 细胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸盐形成；⑦ 辅酶A生物合成。

DKD组患者在以下代谢功能上更好(P<0.05)，具体包括：① 脂多糖生物合成；② 三羧酸循环；③ 糖基转移酶；④ 糖异生；⑤ 鞘糖脂生物合成；⑥ 三羧酸循环；⑦ 糖基转移酶代谢；⑧ 细菌毒素降解；⑨ 色氨酸代谢；⑩ 缬氨酸亮氨酸代谢；霍乱弧菌感染；磷酸转运系统；无机物的运输和代谢；聚糖生物合成；金黄色葡萄球菌感染；丙酸代谢；细胞运动和分泌；脂多糖生物合成蛋白；抗坏血酸；香叶醇代谢功能。

在以下代谢功能上则相对较差(P<0.05)，具体包括：① 硫胺素代谢；② 赖氨酸生物合成；③ 卟啉代谢；④ RNA转运；⑤ 苯丙氨酸生物合成；⑥ 酪氨酸生物合成；⑦ 甲烷代谢功能；⑧ 钙信号通路；⑨ 色氨酸生物合成功能。

注：蓝色为对照组，红色为T2DM组，绿色为DKD组。

3 讨论

本文针对T2DM和DKD患者的肠道菌群情况进行了分析，结果发现，两种患者的肠道菌群与健康人群相比，其α多样性指数相对较低，此研究结果与相关学者的研究观点一致[10]。本研究也受地域的影响，不同地域的饮食结构存在一定的差异，因此，代谢类疾病的肠道菌群失衡模式可能存在一定的差异。但大多数研究均显示拟杆菌门所占比例呈上升状态[11-13]，而厚壁菌门所占比例则呈下降状态。在本研究中显示，对照组与T2DM组和DKD组之间的肠道菌群结构上差异无统计学意义，但从研究数据中可发现厚壁菌门/拟杆菌门的比例上存在不同，但其比例的不同并不影响整体结构。其主要原因可能是两组患者仅在厚壁菌门/拟杆菌门比例上存在差异，其余变化均比较一致，例如在门水平上，两组患者均显示为蓝藻细菌门和厚壁菌门减少，在门水平上，则以厚壁菌门和蓝藻细菌门数量较低为特点。从相关学者的研究中也可发现[14]，在T2DM患者肠道中出现了梭菌减少和乳酸杆菌富集的情况，有学者也指出[15]，T2DM患者的肠道中产生柔嫩梭菌属、罗斯菌等丁酸盐细菌的减少，而像多枝梭菌、粪拟杆菌、大肠埃希菌以及迟缓埃格特菌等致病菌则会显著增加。有学者指出[16]，罗斯菌定值和高植物多糖饮食会增加肠道内丁酸的水平，并降低主动脉的炎症因子的水平，在一定程度上减小动脉粥样硬化斑块的体积。

肠道菌群功能变化方面来看，结果显示，T2DM组与DKD组患者肠道的功能变化存在一致性，其一致性主要表现在以下两方面：一方面为相关菌群功能的增强，例如萘降解、链霉素生物合成、核苷糖代谢、氨基糖代谢、谷胱甘肽代谢以及蛋白质折叠等。另一方面为相关菌群功能的降低，主要表现在7种菌群的变化：① 甘油磷酸酯代谢；② 细菌趋药性；③ 信号传导机制；④ 细胞骨架蛋白；⑤ 孢子形成；⑥ 泛酸盐形成；⑦ 辅酶A生物合成。从两方面的变化体现了T2DM和DKD患者肠道菌群功能变化存在一致性，从此结果也可发现DKD患者的菌群变化和糖尿病患者出现了同样的菌群变化形式，只是在DKD患者中又出现了个别菌群的紊乱，例如肠球菌和棒状杆菌的升高，此观点与既往研究[17]结果相一致，即两种菌在慢性肾病患者肠道中呈高表达水平，并且进行粪菌移植后的小鼠出现了肾功能损伤。此结果显示了DKD患者菌群变化是在T2DM基础上发生了其他关键特征性变化的，同时也加速了DKD的发展。

综上所述，T2DM和DKD患者在肠道菌群失衡方面的变化比较一致，均表现为丁酸菌的减少，但同时也存在一定的特异性变化，从肠道菌群功能变化方面来看二者变化呈多数一致状态。