羟基红花黄色素A对大鼠避水应激所致结肠高动力的抑制作用及其机制

肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种慢性复发性的功能性胃肠道疾病，最常发生在20～30岁的人群中

。IBS临床诊断标准为：反复发作的腹痛，过去3个月内每周发作至少1 d，腹痛与排便有关，或伴有大便性状或频率的改变。在诊断前，症状至少出现6个月且近3个月症状必须符合诊断标准；且无任何可识别的器质性病变

。目前IBS的病因及机制仍不明确，被认为是一种生物-心理-社会紊乱，其关键因素是脑-肠相互作用的改变，脑-肠互动异常与肠道运动障碍、内脏高敏和自主胃肠反应紊乱有关。目前，随着城市化进程的加快，人们的生活节奏加快、生活压力骤增、生活成本增加，抑郁、焦虑等精神心理障碍人群增加，故各种急慢性心理及生理应激刺激在IBS发病中的重要作用日益得到研究者的重视。

羟基红花黄色素A(hydroxy safflower yellow A,HSYA)是从红花中提取出来的主要成分之一，已被证实具有活血化瘀、通脉止痛等功效

。HSYA可能参与调节胃肠道运动，但证据不足，其潜在机制尚不清楚。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)属于模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)，是天然免疫防御系统的一个重要组成部分，Toll样受体4(Toll like receptor 4,TLR4)是TLRs家族中最早发现的成员之一，Tak-242是一种选择性的TLR4信号传导抑制剂。目前有研究表明，HSYA通过作用于TLR4信号通路发挥其作用

，也有研究表明，TLR4信号通路的激活与IBS肠道炎症、屏障功能障碍、内脏超敏反应(visceral hypersensitivity,VH)和IBS症状密切相关

。

历朝有宵禁制度，只有在诸如元宵节这样的特殊日子里，才允许普通百姓夜间出外走动。那么，古代的宵禁制度从何时开始，又走过了怎样的发展历程呢？

因此，我们推测HSYA可能通过作用于结肠组织中的TLR4信号通路，发挥其结肠平滑肌舒张作用。在本研究中，我们研究了：(1)HSYA对避水应激大鼠胃肠动力的影响；(2)HSYA是否通过TLR4受体介导通路影响胃肠动力。本实验旨在通过观察HSYA对大鼠离体结肠平滑肌作用的影响及其可能机制，以确定HSYA舒张结肠平滑肌的作用，为其进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1.1 实验动物：体质量为130～150 g的雄性清洁级Wistar大鼠15只，购自湖北省疾病控制中心动物室[动物许可证编号：SYXK(鄂)2015-0027，湖北]，饲养于清洁级实验室(SPF)环境中，置于温度(22 ℃)正常的明暗周期控制室中，并提供食物和水。在适应1周后，大鼠接受实验方案。所有方案均经武汉大学人民医院动物保护与使用制度委员会批准，并遵循国际疼痛研究协会伦理指南。

1.2.2 动物模型建立：将大鼠置于贴于有机玻璃笼(45 cm×25 cm×25 cm)的透明水箱正中心的木板平台(10 cm×8 cm×8 cm)上，笼内灌满室温水(25±2)℃，距平台最高点1 cm，每次1 h，连续10 d，建立避水应激模型。SWAS组大鼠被放在同样规格的有机玻璃笼中心的木板平台上，但笼内不装水。WAS+HSYA组大鼠于每天进行避水应激前半小时，以60 mg/kg的HSYA对其进行灌胃，而WAS组以相同的生理盐水灌胃，SWAS组则不做处理。这些操作于每天早上9点进行。

2.4 病理学特征 癌变易发生于单侧卵巢，肉眼与MCT很难区分，囊性肿瘤内可见毛发、脂肪、头皮等。鳞癌变的畸胎瘤囊壁较厚，囊壁与卵巢组织界限不清，术中分离困难，结节、斑块、乳头或菜花样物长入囊肿壁，作为恶性肿瘤指标。肿瘤细胞浸润的模式最早在1997年Kikkawa等[13]提出，分为 3种模式：α模式指肿瘤细胞与正常基质之间有明确的边界；γ模式指肿瘤和基质没有明显边界，呈相互浸润及扩散；β模式介于两者之间。

如图5所示，Tak-242(30 μmol/L)孵育15 min显著阻断HSYA对大鼠结肠环行肌和纵行肌自发性收缩活性的抑制作用。

为了使PCB实现高质量、高效率和低成本的生产，必须对SMT的成产过程进行实时监控。该软件的设计可以用于对焊膏印刷机实时运行状态、故障、任务及其它制造信息进行灵活的统计、分析。对于采集到的制造数据进行分析，将其转换成动态曲线的形式显示出来。实现了设备信息深层次分析，加强了对生产过程的监管力度，提高了监控生产过程的能力。本软件可以广泛的用在含有焊膏印刷机的电子电路制造平台上。

1.2.1 实验动物分组：将选用的15只Wistar大鼠称量体质量后按随机数字表法分为3组，分别为：SWAS组(假性避水应激)、WAS(避水应激)组、WAS+HSYA组，每组5只。

“56岁”的美加净和“59岁”的大白兔奶糖跨界合作，前一段时间在网上的讨论度是盛况空前。两者推出联名款——美加净牌大白兔奶糖味润唇膏，完美保留大白兔奶糖的经典味道。9月20号十点整在天猫旗舰店限量销售920套，不到半秒被抢空。据悉，这款润唇膏10月正式推出，“双十一”之前面市。

1.1.2 主要试剂：HSYA冻干粉(货号：PS0782-0100)购自成都普思生物科技股份有限公司；河豚毒素(TTX)(货号：X2254-10MG)、二甲基亚砜(DMSO)(货号：D2650)、葡萄糖(Glucose)、羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)、Tris-HCl、NaOH购自美国Sigma公司；Tak-242(货号：HY-11109)购自美国MCE(MedChem Express)公司；0.9%氯化钠注射液购自广西裕源药业有限公司；NaCl、KCl、CaCl

、MgCl

、磷酸二氢钠(NaH

PO

)、磷酸氢二钠(Na

HPO

)购自国药集团化学试剂(沪试)有限公司。

麻省理工学院研究人员约尔·福林克及其同事，此次从一块较大的聚合物预制件着手，将半导体器件嵌入预制件的中空通道。然后，一边将导线穿进中空通道，一边加热并拉伸该预制件，从而形成延展的纤维束。这样一来，电连接的光发射或光探测二极管在纤维束内轴向均匀地分布开来。该工艺具有内在可扩展性，可以制造出数百米长的功能性纤维。一旦经过拉伸处理，这些纤维就可以很容易地织进织物中。研究团队将这些二极管纤维放进标准的家用洗衣机中转十圈，发现其性能没有受损，证明了它们的耐用性。他们还表明，可以在包含光探测和发光纤维的两种纺织品之间建立起双向光通讯链接。不仅如此，这种智能纺织品也可用于测量穿戴者的心率。

1.2.4 大鼠结肠肌条收缩活性测定：(1)于实验第11天，将三组大鼠分别断颈处死后剖腹，在距回盲瓣1 cm处取约3 cm长的结肠，置入充有体积分数为95%的O

和5%的CO

混合气体的台氏缓冲液中，沿肠系膜处剪开肠管并漂洗干净，黏膜面朝上并用细银针固定于硅胶板(在直径为10 cm的玻璃平皿上铺sylgard硅胶)上，解剖显微镜下迅速剥离黏膜和黏膜下层，沿肠管纵轴走向剪取纵行肌条(3 mm×8 mm)，沿横轴走向剪取环行肌条(3 mm×8 mm)。整个取材过程尽量轻柔，避免肌条活性丧失。将肌条置于盛有恒温(37 ℃)台式缓冲液的浴槽中(容积约6 ml)，并持续充有体积分数为95%的O

和5%的CO

的混合气体，肌条的一端固定在HSS1(B)型恒温浴槽底部挂钩，另一端用丝线固定于TD-1125型张力换能器上。给肌条一定的前负荷(环行肌1.0 g前负荷，纵行肌1.5 g前负荷)，孵育1 h，台式液每隔30 min予以更换。每只大鼠选取出现规律收缩的环行肌和纵行肌各一根记录机械收缩信号，用RM6240多通道生理信号系统(成都)记录各条带的收缩幅度和频率。(2)另取正常大鼠结肠制备环行肌条和纵行肌条并在器官浴槽系统进行肌条实验，当出现一段规律收缩信号后，可进行其他的相关处理：(1)每间隔5 min向浴槽内依次加入浓度梯度的HSYA溶液(终浓度分别为0.6、1.2、1.8 mol/L)，观察并记录其自发性收缩的幅度和频率的变化；(2)提前用TTX溶液(终浓度为1 μmol/L)孵育肌条10 min，再以相同浓度梯度的HSYA溶液(终浓度分别为0.6、1.2、1.8 mol/L)间隔5 min处理肌条，观察并记录其自发性收缩的幅度和频率的变化；(3)提前用Tak-242溶液(终浓度为30 μmol/L)孵育肌条15 min，再以相同浓度梯度的HSYA溶液(终浓度分别为0.6、1.2、1.8 mol/L)间隔5 min处理肌条，观察并记录其自发性收缩的幅度和频率的变化。

2.1.1 避水应激使大鼠粪球排出量显著增加：避水应激导致大鼠肠道运动活动显著增加。在实验期间，连续10 d，每日WAS组大鼠的平均每小时排出的粪便颗粒数量均高于SWAS组(见图1A)。在10 d的周期内，WAS组大鼠的每小时排出的粪便颗粒数显著高于SWAS组[(4.20±0.47)颗

(1

60±0

14)颗，

=5，

<0.05](见图1B)。

1.2.3 排便数量测定：在整个实验过程中，对每组大鼠的24 h排出粪球颗粒进行计数。此操作固定于每天造模结束时，对各组大鼠笼内粪便颗粒数量进行测定。计算各组每天平均每小时排出粪球量，可评估大鼠的结肠动力状况。

慢性阻塞性肺疾病在中医学中是喘证、咳嗽、哮病等多种肺系疾病进展成的“肺胀”，中医学者多认为本病是因久病肺虚、肺不敛降、痰浊潴留、气还肺间、肺气胀满，复感外邪所致[8-10]。慢性阻塞性肺疾病患者病程迁延，日久可累及肾脏、脾脏等，导致肾脏、肺脏、脾脏亏虚，而脾肺肾三脏气化功能失调，可致痰浊水湿内停，逐渐成瘀，最终形成血瘀、痰浊、水饮交错相杂的病症。其中，稳定期慢性阻塞性肺疾病属于本虚标实之症，并以虚症为主，往往兼杂痰湿、血瘀。

2 结果

陈振豪[32]等结合上海地区实行的峰谷电费差价政策，提出了一套适用于空气源热泵热水器的控制方案。该控制方案采用多模式流程控制，用户可以根据需求不同和季节变化自行选择不同的工作模式。实验结果表明，该流程控制方案可以显著地提高系统的能效比和经济性，具有推广价值。

2.1.2 避水应激使大鼠近端结肠的收缩活性显著增加：避水应激使大鼠近端结肠自发收缩显著增加。与SWAS组大鼠相比，WAS组大鼠的环行肌条和纵行肌条的平均收缩幅度均显著升高(环行肌：0.90±0.08

0

45±0

07，

<0

05；纵行肌：1

30±0

10

0

70±0

10，

<0.05)(见图2)。

2.2.1 HSYA显著降低慢性避水应激大鼠的粪球排出量：HSYA显著降低避水应激大鼠的结肠活动。在实验期间，连续10 d，每天HSYA+WAS组大鼠的平均每小时排出粪便颗粒数量均低于WAS组(见图1A)。与WAS组比较，HSYA+WAS组大鼠的平均每小时排出粪便颗粒数显著降低[(2.76±0.42)颗

(4

20±0

47)颗，

=5，

<0.05](见图1B)。

2.2.2 HSYA显著降低避水应激大鼠的结肠动力：HSYA显著降低避水应激大鼠的结肠活力。与WAS组比较，HSYA+WAS组大鼠的环行肌条和纵行肌条的平均收缩幅度均显著降低(环行肌：0.60±0.09

0

90±0

08，

<0

05；纵行肌：0

90±0

12

1

30±0

10，

<0.05)(见图2)。

如图3所示，HSYA以剂量依赖的方式抑制正常大鼠的纵行肌条和环行肌条的自发收缩。浴槽中加入HSYA前，环行肌条的平均振幅为(0.74±0.09)g，浴槽中加入浓度梯度的HSYA溶液(终浓度分别为0.6、1.2、1.8 mol/L)后环行肌条的平均振幅分别为(0.52±0.07)g、(0.33±0.06)g和(0.22±0.04)g，差异有统计学意义(

<0

05)。同样，纵行肌条在添加HSYA前的平均收缩幅度为(1.10±0.12)g，而在以浓度梯度的HSYA溶液(终浓度分别为0.6、1.2、1.8 mol/L)加入浴槽后时，平均收缩幅度分别为(0.72±0.11)g、(0.43±0.05)g和(0.30±0.07)g，差异有统计学意义(

<0

05)。TTX(终浓度为1 μmol/L)预孵育10 min不影响HSYA对正常大鼠离体肌条自发性收缩活性的抑制作用(见图4)。

3 讨论

在本研究中，我们研究了HSYA在体内和体外对大鼠结肠自发性收缩动力的影响及其潜在机制，本研究结果表明：(1)慢性避水应激大鼠胃肠动力增强，假性避水应激对胃肠动力几乎无影响；(2)HSYA显著抑制结肠肌条(环行肌和纵行肌)的收缩活性，且呈浓度梯度依赖性；(3)TTX不能阻断HSYA对结肠收缩的抑制作用；(4)Tak-242能完全阻断HSYA对结肠收缩的抑制作用。因此，我们推测HSYA对大鼠结肠运动的抑制作用可能是通过TLR4受体通路。

随着生活节奏的加快，竞争加剧、生活成本增加等社会因素，IBS患者呈现年轻化、群体化发展，故应激在其发病机制中的作用越来越引起重视

，HSYA与胃肠道运动密切相关，但对于其在IBS中的具体作用机制目前尚不清楚。避水应激模型很好地模拟了对于困境的恐惧及适应，对于求生的渴望及求生技能的熟练掌握，对于承受突发打击的敏感，很好地模拟了现实生活的应激环境，是目前国际比较成熟且公认的IBS模型

。研究表明，避水应激通过TLR4和促炎细胞因子途径诱导内脏触痛和结肠高通透性，形成大鼠IBS模型

。在本研究中，我们采用经典IBS避水应激模型以模拟现实生活中应激环境，造模期间大鼠粪

便排泻被计量以评估其结肠动力变化；其次，我们运用肌条实验评估各组大鼠结肠动力变化及HSYA对于正常大鼠结肠平滑肌肌条自发性收缩的影响，并观察以神经阻滞剂TTX阻滞神经作用后对于结肠平滑肌收缩的影响；从在体动物实验、离体肌条实验两个层面来探讨避水应激及HSYA对结肠动力的作用。

HSYA是从红花中提取出来的主要成分之一，由Meselhy等

于1993年首次从红花中分离得到。其具有多种生物学活性，已被证实具有活血化瘀、通脉止痛等功效，系统评价表明，HSYA注射剂对心绞痛和脑梗死均有显著疗效

。除了对心血管疾病的作用外，HSYA还具有神经保护

、抗癌特性

、代谢调节

以及对肝、肺和内皮细胞的保护作用

。另有多项研究表明，HSYA对平滑肌表现有舒张作用：李琳等

对离体猪冠状动脉血管实验表明，HSYA通过内皮-NO-cGMP途径发挥血管平滑肌的舒张作用，且能阻断血管平滑肌上的电压依赖性钙通道。史向华等

对小鼠离体子宫平滑肌实验表明，HSYA具有舒张子宫平滑肌的作用。然而，HSYA对结肠平滑肌的调节作用及对结肠运动影响的研究较少。

最近实验证实，IL-6、IL-1β和TLR4通路介导了WAS诱导的内脏改变

，这与LPS诱导的IBS模型类似。这些结果表明TLR4细胞因子信号通路对IBS意义重大

。HSYA对肠蠕动的影响不确定，其具体作用机制尚不清楚。在我们的研究中证明了HSYA以浓度梯度依赖地抑制了离体结肠肌条(包括环行肌和纵行肌)的自发性收缩活性。为了研究肠神经元是否参与HSYA诱导的结肠肌条抑制作用，我们用TTX阻断神经作用。结果表明，抑制作用未被TTX预处理阻断，HSYA对结肠肌条的抑制作用仍然存在，说明HSYA可直接作用于结肠平滑肌细胞而影响结肠平滑肌收缩。TLR4受体拮抗剂Tak-242完全阻断了HSYA对大鼠结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用，提示HSYA可能是通过TLR4信号传导途径发挥其作用。

（1）[薛素姐]把狄希陈的双手拶上，叫他招供。拶得狄希陈乔声怪气的叫唤。（明·西周生《醒世姻缘传》第63回）

然而，我们的研究可能还存在一些问题。首先，大鼠在体外器官浴研究前未禁食，因此肠道内容物可能改变体外收缩力；其次，尽管我们的操作一直很温和且符合操作规范，大鼠结肠取材和清洗过程中也可能影响体外肌条的活性。在我们的研究中，TLR4受体拮抗剂Tak-242完全阻断了HSYA对大鼠结肠平滑肌自发性收缩的抑制作用。因此，关于是否存在另一种途径，答案可能是肯定的，因为胃肠动力受多种因素调控，而HSYA是一种多靶点药物。此外，HSYA还有众所周知的降压作用

，有研究表明，HSYA的血管舒张作用是通过受体介导的Ca

通道阻断Ca

内流造成的

。尽管如此，这些机制是否能够解释肠道运动调控的抑制作用仍需进一步研究。

虽然HSYA调控大鼠结肠运动的机制尚需进一步研究，但其对大鼠结肠自发性收缩的抑制作用仍需得到肯定。此外，大多数学者认为其病理生理机制包括结肠运动能力的改变和内脏过敏。IBS以腹痛和结肠黏滞性为主要特征。在我们的研究中，我们用慢性避水应激建立了一个高运动性大鼠模型，并证明HSYA显著抑制离体结肠肌条自发性收缩活性。也就是说，HSYA作为一种治疗腹泻，尤其是IBS的新药具有开发潜力，但仍有许多工作需要做。

综上所述，我们的研究证明HSYA能逆转应激性肠道动力亢进，这种效应可能与TLR4受体通路有关，本研究可为临床用药提供理论依据。

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