肝硬化患者肠道菌群的初步分析及肠型分析

肝硬化是各种慢性肝病逐渐发展演变为肝脏弥漫性纤维化、假小叶形成为主要特征的病理阶段。肝硬化与发生原发性肝细胞癌的风险相关，晚期肝硬化是一种危及生命的疾病且治疗选择有限。因此，肝硬化造成了很大的公共卫生负担

。2014年全球肝硬化疾病新负担估算研究表明

，肝硬化在2010年造成超过100万人死亡。

采用单因素变量法考察了称样量对测定的影响。分别选用称样量为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g进行试验，结果见表3。由表3可见：当称样量不大于1.0g时，测定结果的相对标准偏差(RSD)较大，这可能是因为称样量太小，样品代表性较差；当称样量大于1.0g时，测量结果的RSD较小。考虑到称样量大于3.0g时，消耗的硝酸-酒石酸混酸和滴定液体积会相应增多，最终实验选择称样量为2.0g。

本研究采集80例就诊于福建省立医院消化内科的肝硬化患者及40名福建省立医院体检中心健康志愿者的粪便标本，通过16s rDNA测序技术检测粪便肠道菌群。首先，分析比较肝硬化组与健康对照组肠道菌群多样性及组成的差异；其次，比较肝硬化代偿期组与肝硬化失代偿期组、不同Child-Pugh分级肝硬化组、肝硬化无合并腹水组与肝硬化合并腹水组肠道菌群的变化；再通过肠型分析，预测肝硬化肠型对于疾病及严重程度的判断，旨在初步分析肝硬化患者肠道菌群的变化，为临床辅助评估肝硬化病情提供多一个无创的新指标，也为从微生态角度治疗肝硬化提供多一些临床证据。

1 资料与方法

选取2019年1月至2019年12月就诊于福建省立医院消化内科的肝硬化患者80例，同期选取福建省立医院体检中心健康志愿者40名。肝硬化患者的纳入标准：组织学或影像学符合肝硬化者可诊断为代偿期肝硬化；在诊断肝硬化基础上，出现门静脉高压相关并发症如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征等者可诊断为失代偿期肝硬化。肝硬化患者的排除标准：(1)合并严重心、脑、肺、肾等脏器功能不全者(不包括肝性脑病、肝肺综合征、肝肾综合征)；(2)既往有胃肠道手术病史及消化道肿瘤、肠易激综合征、炎症性肠病、感染性腹泻等其他消化道疾病；(3)孕期、哺乳期妇女及儿童；(4)采集粪便标本前4周内应用过抗生素及微生态制剂。健康志愿者的排除标准：(1)呼吸系统、消化系统、血液系统、内分泌系统、心脑血管系统、泌尿系统、神经精神系统等慢性疾病者；(2)脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病者；(3)BMI≥24 kg/m

；(4)酗酒者；(5)孕期、哺乳期妇女及儿童；(6)采集粪便标本前4周内应用过抗生素及微生态制剂。本研究经福建省立医院医学伦理委员会审批通过[伦审科研第(K2018-09-010)号]，研究对象均签署知情同意书。

收集研究对象基本临床资料及留取当天第1次新鲜粪便标本0.3～0.5 ml(1 h内保存至标本盒)。样本送至杭州晶佰生物科技有限公司，该公司采用天根生化科技(北京)有限公司的粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328)提取样品DNA，进行V3-V4 rDNA扩增子文库构建(扩增引物：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。每个样品文库质控合格后，进行文库Pooling及上机测序。使用软件cutadapt(v1.18)将原始数据PE(paired-end)去引物，以确保数据是目标片段；使用软件pandaseq(v2.11)将不含引物PE(paired-end)序列拼接成长tags；使用软件python3对拼接长tags进行质控；采用软件vsearch对高质量长序列进行去嵌合体；对去除嵌合体的高质量数据按相似度97%进行操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)聚类，挑选代表序列；使用rdp-classifier(v2.12)对代表序列进行物种注释(数据库为rdp-classifier)；使用Qiime流程得到OTU丰度表和物种丰度表，使用软件R(v3.5.2)语言统计绘制物种组成柱状图、差异物种图、主坐标分析(Principal Coordinats Analysis, PCoA)、肠型等图表。

姜超，男，1978年10月生，陕西长安人，高级工程师，主要从事土地综合开发和交通项目建设管理，E-mail：16361273@qq.com

2 结果

该研究共纳入肝硬化患者80例，男50例，女30例，年龄(57.0±13.6)岁；健康志愿者40名，男20名，女20名，年龄(57.7±13.5)岁。两组的性别、年龄比较，差异无统计学意义(

>0.05)。在肝硬化患者中，肝硬化代偿期34例，肝硬化失代偿期46例；Child-Pugh A级组45例，Child-Pugh B级组24例，Child-Pugh C级组11例。

2.4.1 差异物种比较：Child-Pugh A级组中主要有

__

、

、

，Child-Pugh B级组中主要有

、

、

，Child-Pugh C级组中主要有

(见图5)。

2.3.2 肠型分析：肠道菌群以

(埃希氏菌属)为主的肝硬化患者发展为失代偿期肝硬化的风险是肠道菌群以

(普氏菌属)为主的3.64倍(

<0.05，见图4、表2)。因此可以推测，肠型Ⅰ(

)是肝硬化发展为失代偿期的危险因素。

2.4.2 Child-Pugh评分与肠道菌群主要物种相关性分：

、

、

平均相对丰度百分比与Child-Pugh评分呈正相关，差异有统计学意义(

<0.05)；

、

、

平均相对丰度百分比与Child-Pugh评分呈负相关，差异有统计学意义(

<0.05)(见表3)。

2.3.1 差异物种比较：在属水平，肝硬化失代偿期组

__

、

、

平均相对丰度百分比小于肝硬化代偿期组(

=0.004、0.029、0.004)，差异有统计学意义；

、

平均相对丰度百分比大于肝硬化代偿期组，差异有统计学意义(

=0.003、0.001)(见图3)。

2.2.2 肠型分析：肠道菌群以

(埃希氏菌属)为主的人群罹患肝硬化的风险是肠道菌群以

(普氏菌属)为主的人群的5.28倍(

<0.05)(见图2、表1)。因此可以推测,肠型Ⅰ(

)是罹患肝硬化的危险因素。

在属水平，肝硬化并发腹水组

__

、

平均相对丰度百分比小于肝硬化未并发腹水组，差异有统计学意义(

=0.025、0.001)；

、

平均相对丰度百分比大于肝硬化未并发腹水组，差异有统计学意义(

=-0.002、0.047)(见图7)。

在此次提交的报告中，有一个来自OECD国家和中国的税收和转移支付前后基尼系数变化的图表，采用的是2000年-2010年OECD国家和中国的数据。从表中可以看出，在税收和转移支付之前，除希腊与德国以外，各国基尼系数都在0.4以上，超过警戒线，于是各国都采取了税收和转移支付政策（如补贴），在这10年的区间内，大部分国家通过减税和补贴，基尼系数都有明显的下降，甚至降到警戒线以下。只有中国仅从0.443降至0.41，调节作用微乎其微。

2.2.1 差异物种比较：在属水平，肝硬化组

(普氏菌属)、

(粪栖杆菌属)、

(罗斯拜瑞氏菌属)、

__

(瘤胃球菌科下的未知属)平均相对丰度百分比小于健康对照组，差异有统计学意义(

=0.042、0.000、0.000、0.013)；

(埃希氏菌属

志贺氏菌属)、

(链球菌属)平均相对丰度百分比大于健康对照组，差异有统计学意义(

=0.023、1.702×10

)(见图1)。

表2是2004—2018年国内移动阅读研究排名前10位的高被引文献，这些文献主要来自于图书情报学科领域，主题涉及移动图书馆的应用、移动信息服务、移动阅读推广、手机移动阅读等方面。高产作者茆意宏有3篇文章位列被引频次前十名，其3篇高被引文章重点关注了手机移动阅读的过程及影响因素、图书馆移动信息服务的现状及需求满足对策等。

2.4.3 肠型分析：肠道菌群以

(埃希氏菌属)为主的肝硬化患者发展为Child-Pugh C级的风险是肠道菌群以

(普氏菌属)为主的患者的7.2倍(

<0.05)(见图6、表4)。因此可以推测，肠型Ⅰ(

)是肝硬化患者发展为Child-Pugh C级的危险因素。

（2）黄土冻融循环的相关研究中仍然存在一个问题没有攻克，即三场耦合的影响，该方面的相关研究结论较少，黄土体由于受到气候、自重、其他附加荷载等多种因素影响，因此其自身温度场、水分场、应力场均处于动态变化的状态。同时，由于没有现实成果作为支持，这一研究没能从现实角度解决问题，对于该问题未来将仍需要进行研究，研究成果出现后才能解决困扰诸多专业学者的季节性冻土地区黄土灾害问题。

3 讨论

肠道有100万亿个微生物，有1 000～1 150种微生物群

。根据其功能大致可分为三类

：共生菌或益生菌，即专性厌氧的肠道优势菌，如乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌等；共生菌即条件致病菌，如大肠埃希菌、肠球菌和链球菌等，其在适合数量时具有一定的生理功能，但达到一定数量时则致病；过路菌，多数具有致病性，如变形菌门、绿脓杆菌等，它们在微生态环境保持平衡的情况下数量较少不致病，但在肠道菌群失调的情况下可转化为致病菌。

越来越多的研究表明，肠道微生态的变化与肝硬化的发生及其发展密切相关。已有研究表明，肝硬化患者在肠道菌群构成、菌群失调指数等方面与健康人均有显著性差异

。本研究发现，肝硬化患者肠道菌群存在微生态的失衡，如

的减少和

、

、

、

的增多。失代偿性肝硬化组肠道菌群主要表现为

__

、

、

的减少及

、

的增多。另外，

和

的平均相对丰度百分比与Child-Pugh评分呈显著正相关,与既往研究

大致相同。胆汁酸代谢异常、小肠细菌过度生长及小肠动力紊乱、病理性细菌移位、内毒素血症、免疫防御受损是肠道菌群参与肝硬化发生发展的可能机制。

可产生胆酸盐水解酶，参与胆汁酸的正常代谢过程。在肝硬化患者中可以观察到胆汁酸的减少，从而导致如肠杆菌科等致病菌群和促炎微生物的过度生长。而

可与

协同释放内毒素和炎症因子，从而破坏肠道屏障功能

。革兰氏阴性菌(尤其是大肠埃希菌)、肠球菌和链球菌最易转移至肠系膜淋巴结，尤其是大肠杆菌是肝硬化患者自发性细菌感染最常见的病原菌

。某些大肠埃希菌菌株在暴露于炎症应激时，肠黏膜移位更为严重

。据统计

，Child-C级肝硬化患者病理性细菌移位的发生率是Child-A级和Child-B级患者的4～10倍。病理性移位的细菌可通过释放细胞因子和一氧化氮引发炎性反应，加速肝硬化的发展。同时，

的增加和

的减少可以抑制肝脏TLR4，进一步导致胆汁酸减少，加重了肠道菌群紊乱等恶性循环

。

这些具有装备背景的案例加入后，明显提高了学员学习的兴趣，也使老师可以由这些案例引出机械制造工艺知识点，分析制造过程，加工缺陷防治，使课程案例式教学能顺利开展。案例库课堂应用结果表明，案例库的使用明显提高了教学效果，课程内容有了依托，有了支撑，不再空洞难懂；老师的授课更加生动、高效。

短链脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是胃肠道中发酵膳食纤维的细菌产生的主要代谢产物，包括丁酸盐、丙酸盐、乙酸盐等，其在肠道的上皮屏障、炎症抑制、能量代谢等方面发挥了重要的作用。在肠道菌群中，

、

可产生乙酸盐，

、

、

可产生丙酸盐，

、

、

可产生丁酸盐

。而Faecalibacterium能够分泌具有抗炎特性的蛋白质

。在本研究中我们观察到，在肝硬化患者肠道菌群中，能够产生SCFAs或抗炎物质的菌群如

、

、

、

、

明显减少,与Valerio等

的研究结果相一致。

(2)突发的大量漏浆，若是由于槽壁中的先天孔洞，应马上停止施工，并加大孔内送浆量，以保持孔内泥浆面的高度；然后挖出导墙外侧对应位置的土体，查找漏浆源头进行封堵，待处理完成后才能继续进行。

Santiago等

研究发现，与无腹水的患者相比，肝硬化腹水患者的血清微生物中脂多糖结合蛋白水平较高(一种微生物易位的标志)。在本研究中，肝硬化并发腹水患者的肠道菌群主要表现为

__

、

的减少及

、

的增多。这些致病菌与内毒素血症、病理性细菌移位有显著相关性，其产生的大量内毒素通过受损的肠屏障进入体循环，激活肝脏Kupffer细胞，使之释放大量促炎细胞因子，进一步加重肝脏的损伤。因此，当患者未合并明显的自发性腹膜炎，预防性抗感染治疗可能是需要的。

既往研究

根据肠道菌群相对丰度百分比的差异将人类肠道菌群类型分为三种，分别是肠型Ⅰ(

)、肠型Ⅱ(

)、肠型Ⅲ(

)。研究表明

，肠型与长期饮食相关，其中肠型Ⅰ富含拟杆菌属，与蛋白与动物脂肪为主的饮食结构有关；肠型Ⅱ中普氏菌属丰度较高，与碳水化合物为主的饮食结构有关。本研究通过分析发现，肝硬化患者的肠型与健康人群不同，主要为肠型Ⅰ(

)、肠型Ⅱ(

)、肠型Ⅲ(

)，并且研究发现肠道菌群结构以

为主的个体更容易罹患肝硬化且更容易发展为严重的肝硬化，而以

为主的肠道菌群结构似乎是肝硬化的保护因素，研究表明

，以消耗碳水化合物的偏素饮食者的肠道菌群中，

占主导地位。但是否能够运用肠型预测肝硬化的罹患风险及作为肝硬化进展的参考生物标志物，是否提倡肝硬化患者以碳水化合物为主食的饮食结构需要进一步研究证明。

在本研究中，我们通过16s rDNA测序技术对肝硬化患者肠道微生物群进行初步分析发现，有益菌群的减少而潜在致病菌的增加是肝硬化患者肠道菌群的特征，且此特征与肝硬化的严重程度呈明显的正相关。但本研究纳入的例数尚较少，肝硬化患者及健康志愿者均来自福建省立医院，因此还需要大样本多中心的研究。

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