L-肉碱对草龟脂肪代谢的影响

武 帆， 杨振才

（河北师范大学生命科学学院，河北石家庄 050024）

L-肉碱即左旋肉碱，化学名为β-羟基-γ-三甲铵丁酸， 分子式C7H15NO3， 相对分子质量为161.20，是一种多功能有机营养物质，被命名为维生素BT，在脂肪酸的β-氧化中发挥着重要作用，是运输长链脂肪酸的重要载体（杨月英等，2015）。在生物体中，L-肉碱可由必需氨基酸赖氨酸和蛋氨酸在维生素C 和其他次生化合物的存在下自然合成（Geng 等，2019），这种在生物体内自然合成的肉碱被称为内源性L-肉碱。高密度养殖可能会导致动物合成内源性L-肉碱的能力降低，使其不能满足动物体生长代谢的基本需求， 影响动物体的正常生理功能（Li 等，2019）。 缺乏 L-肉碱一般会使动物出现生长缓慢、 脂类代谢紊乱和脂肪肝等问题（王朕朕等，2012），因此需要在饲料中添加外源性L-肉碱。

有关L-肉碱对水产动物脂肪代谢影响方面的研究主要集中在鱼类， 而且对不同动物的研究结果并不一致。 Li 等（2019）发现，添加外源性L-肉碱可增强线粒体β 氧化活性和肉碱棕榈酰转移酶 1 mRNA 的表达。 Ozório 等（2012）研究表明，在饲料中添加L-肉碱降低了虹鳟（Oncorhynchus mykiss）肝脏中游离脂肪酸的含量，表明脂肪酸利用率的增加。董婧（2014）以鲤鱼（Cyprinus carpio）幼鱼为研究对象， 在其饲料中添加150 mg/kg 的L-肉碱，可显著提高鲤鱼肝脏中总脂酶、脂蛋白脂酶、肝脂酶和肉碱棕榈酰转移酶1 的活性，这表明适量外源肉碱的添加可使脂肪酸代谢增强。 而Dias 等（2001）在饲料中添加L-肉碱后，并未对欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）血浆甘油三酯和胆固醇水平以及组织脂质含量造成显著影响。Selcuk 等（2010）在虹鳟的饲料中添加L-肉碱后也未对脂肪代谢有促进作用。影响L-肉碱作用效果的原因可能与饲料中不同脂肪的来源和含量（王立新等，2005）、饲料的能量蛋白比等有关。 这些因素之间的相互作用可能影响了L-肉碱对鱼体脂肪的调节作用。 据推测， 所有相互作用都可能通过影响脂肪酸β-氧化过程中参与的酶的活性来调节L-肉碱在脂代谢中的作用 （Zheng 等，2014）。

草龟是杂食性次生水生爬行动物， 运动能力弱、耐饥饿能力强，对饲料能量要求相对较低。 在草龟养殖中普遍存在体脂含量较高、 生长缓慢的问题。 研究表明，在饲料中添加L-肉碱可显著提高草龟的生长速度、降低肝脏中的脂肪含量（武帆等，2021）。为了阐明L-肉碱对草龟脂肪代谢的影响，本试验通过测定肝脏脂肪代谢酶、血浆脂肪代谢等相关指标，探讨L-肉碱在脂肪代谢方面的作用，为肉碱在草龟饲料中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计 本研究设置饲料中L-肉碱添加水平为 0、100、200、300、400、500 mg/kg 的 6个试验组（L0、L1、L2、L3、L4 和 L5组；L0组为对照组，L1 ～L5组为肉碱添加组），每个试验组设8个重复养殖缸，每个重复缸内养殖10只龟，共480只龟，养殖期为56 d，养殖结束后测定草龟肝脏脂代谢相关酶活性和血浆生化指标。

1.2 试验材料 试验所用基础饲料以鱼粉、鸡肉粉、豆粕等为主要蛋白原料，添加不同含量的L-肉碱，采用双螺杆膨化机（北京现代机械技术有限公司）制成膨化颗粒饲料，蛋白含量为33.33%，能值为 16.44 kJ/g（武帆等，2021）。

试验所用草龟稚龟购自湖北省天门市草龟养殖场，初均重为（8.28±0.54）g。 草龟经药浴消毒处理后挑选大小均一、活动力强的480只草龟，随机分到40个养殖缸中。

1.3 试验方法 养殖试验在河北师范大学生命科学学院水生动物养殖实验室进行， 养殖缸直径为60 cm，高为70 cm，缸内配有电子温控仪，水温控制在（30±0.1）℃。 2 周的驯化结束后，草龟禁食24 h，然后开始正式试验。各组每日3 次饱足投喂不同L-肉碱含量的饲料，投喂半小时后用虹吸管将剩余饵料吸出，试验用水为消毒、曝气之后的自来水，为保持水质清洁，每天换水两次。

试验结束后禁食24 h， 从每缸中随机选取3只草龟，用MS222（北京绿色恒兴生物科技有限公司）麻醉后，断头取血，将每只草龟的血分别放入四周涂抹肝素钠的2 mL 离心管中， 置于离心机中离心（4000 g/min，15 min），获得上清液，进行血浆生化指标的测定。 随后在冰盘上对龟体进行解剖，分离出肝脏，将肝脏置于液氮中速冻后，储存在-80 ℃。 后续测样时，从每组随机选取5个养殖缸，每个养殖缸中随机选取一只草龟的肝脏，用于肝脏脂代谢相关酶活性的测定。

采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定肝脏组织样本中肝脂酶（HL）、脂肪酶（LPS）和脂蛋白脂酶 （LPL） 的活性。 采用全自动生化仪（mindary BS-180）测定血浆中总蛋白TP、甘油三酯 TG、 总胆固醇 TC、 高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）的含量，以及谷草转氨酶AST 和谷丙转氨酶ALT 的活性。

1.4 统计分析 采用Statistica10.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），各试验组间的差异采用Duncan’s 多重比较，各肉碱添加组与对照组的差异采用LSD 检验，P ＜0.05 表示差异显著。

2 结果

2.1 饲料中L-肉碱添加量对草龟肝脏脂代谢相关酶活的影响 如表1 所示，L1组草龟肝脏的肝脂酶活性[F（5，24）=2.973，P=0.03156 ＜ 0.05]和脂蛋白脂酶活性[F（5，24）=3.156，P=0.02496 ＜ 0.05]较对照组分别提高了94.87%和92.86%。 脂肪酶活性[F（5，24）=0.3445，P=0.8807＞0.05]在各组间无显著性差异， 但肉碱添加组的脂肪酶活性与对照组相比均有不同程度的升高。

表1 饲料中L-肉碱添加量对草龟肝脏脂代谢相关酶活的影响

2.2 饲料中L-肉碱添加量对草龟血浆生理生化指标的影响 由表2 可知， 各组之间的谷草转氨酶活性[F（5，24）=3.166，P=0.02466 ＜ 0.05]具有显著性差异，其中L0组显著高于其余各组。 谷丙转氨酶活性[F（5，24）=3.297，P=0.02088 ＜ 0.05]在各组间也有显著性差异，其中L0组显著高于L2组和L3组，其余各组间没有显著性差异，且随着L-肉碱添加量的提高呈现出先下降后上升的趋势。L2组和L3组的谷丙转氨酶较对照组分别降低42.57%、45.87%。 总蛋白[F（5，24）=0.6057，P=0.6962＞0.05]、总胆固醇[F（5，24）=0.5572，P=0.7315＞0.05]、甘油三酯[F（5，24）=0.5937，P=0.7050＞0.05]、高密度脂蛋白胆固醇[F（5，24）=0.8291，P=0.5416＞0.05]和低密度脂蛋白胆固醇[F（5，24）=0.3857，P=0.8536＞0.05]在各组之间差异不显著。

表2 饲料中L-肉碱添加量对草龟血浆生理生化指标的影响

3 讨论

添加外源性L-肉碱对脂肪代谢的促进作用在很多文献中都有报道， 有着较为一致的结论（Ozório 等，2012；Hajiabadi 等，2009）。在脂肪酸的β 氧化过程中，L-肉碱作为载体将长链脂肪酸转运进线粒体内膜， 从而使β 氧化过程顺利进行，促进脂肪的代谢。

肝脂酶和脂蛋白脂酶均属于脂肪分解酶，是内源性甘油三酯代谢的两种关键酶。 当肝脂酶和脂蛋白脂酶缺陷或活性降低时， 肝细胞内的甘油三酯合成量会增加并在肝内堆积（崔璨，2007）。肝脂酶和脂蛋白脂酶活性的降低可引起高血脂症，且与脂肪肝的发生有关 （丁雪芬，2007）。 在草鱼（Ctenopharyngodon idella） 饲料中添加外源性L-肉碱可显著提高肝胰脏中肝脂酶和总脂酶的活性，从而促进肝胰腺脂肪的降解（田娟，2009）。 苟庚午等 （2016） 研究表明， 在吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）饲料中添加 150 mg/kg 的 L-肉碱，可显著提高肝脏脂蛋白脂酶、肝脂酶和脂肪酶的活性。 本试验在添加外源性L-肉碱后，虽然对草龟肝脏脂肪酶的活性并没有显著影响， 但可显著提高肝脏肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性， 整体呈先升高后降低的趋势， 其中L1组显著高于对照组，L5组的酶活性还略微低于对照组。 说明草龟饲料中添加100 mg/kg 的L-肉碱，可促进肝脏脂肪的分解，但L-肉碱添加剂量过高也会抑制肝脏中脂酶、肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性。

血液中甘油三酯和胆固醇同属于血脂，是反映脂肪代谢的重要指标（丁艳艳，2012）。 根据现有的研究来看，L-肉碱对不同水产动物血脂水平影响多种多样。 在饲料中添加L-肉碱可显著降低欧洲舌齿鲈（Santulli 等，1986）、牙鲆（高小强等，2012）（Paralichthys olivaceus）幼鱼和幼鲤（董婧等，2014）血液中甘油三酯和总胆固醇的浓度；而虹鳟饲料中添加外源性L-肉碱， 显著提高了血浆中甘油三酯和胆固醇的含量 （Jalali 等，2010）。 还有的对血液中甘油三酯和总胆固醇影响不同，如草鱼饲料中添加200 mg/kg L-肉碱显著降低了血清中胆固醇的含量，显著增加了甘油三酯的含量（田娟等，2009），在吉富罗非鱼饲料中添加150 mg/kg L-肉碱可显著降低血清中甘油三酯的含量， 而对胆固醇含量并未造成显著影响（苟庚午等，2016）。另外，还有一些鱼类，如欧洲舌齿鲈、黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）幼鱼、罗非鱼（Oreochromis spp）和银鲈（Bidyanus bidyanus）（Jin 等，2019；Yang 等，2012；Yang 等，2009；Dias等，2001）等，在饲料中添加L-肉碱并未对其甘油三酯和胆固醇含量造成显著影响。 本试验对草龟的研究结果与罗非鱼和银鲈等的相似，添加外源性L-肉碱也未对草龟血浆胆固醇和甘油三酯含量造成显著影响， 肉碱添加组总胆固醇和甘油三酯含量较对照组均有不同程度的增加。 其原因可能是因为添加L-肉碱促进了脂肪酸的氧化， 而脂肪酸氧化产生的乙酰辅酶A 可通过柠檬酸循环进一步氧化， 之后可用于合成酮体、胆固醇和甘油三酯。

谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性是反映肝功能的指标，可用来判断肝脏是否受到损害。正常情况下，它们在血浆中的活性很低，血清转氨酶活性升高说明肝细胞受损（宋国培，1997）。 有研究表明，添加外源性L-肉碱可显著降低血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性（苟庚午等，2016；高小强等，2012；黄凯等，2010）。本试验在饲料中添加L-肉碱使得草龟血浆谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著下降。 说明添加适宜含量的L-肉碱，可对草龟肝脏起到一定的保护作用。 然而，L-肉碱的添加剂量并非越高越好，本试验L4 和L5组的谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性均有明显升高的趋势，如果继续加大L-肉碱的添加剂量，可能会对龟体的肝脏产生一定的损害。

4 结论

在草龟配合饲料中添加100 ～300 mg/kg 的L-肉碱可提高肝脏的脂肪分解能力，促进脂肪酸的氧化，在预防脂肪肝、维护肝脏功能方面有积极作用。