致病杆菌属细菌代谢物抑菌活性研究进展

韩云飞, 他永全, 王 勇,2, 冯俊涛,2, 王永红*,,2

(1. 西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2. 陕西省生物农药工程技术研究中心，陕西 杨凌 712100)

农药是重要的农业生产资料之一，在保障粮食安全中发挥着重要作用，但其不合理使用也带来了一系列问题，例如杀菌剂过量使用引起的病原菌耐药性增强等。为了治理病原菌耐药性的问题，新型杀菌剂的研究与开发显得尤为重要。自然界中几乎所有的微生物都能够产生抑菌物质，这既是一种生存策略，也是一种防御机制[1]，因此从微生物代谢产物中寻找具有抑菌活性的化合物是一种可行的方法。目前我国已经研发成功包括多效霉素、多抗霉素、公主岭霉素、井冈霉素、春雷霉素、申嗪霉素、中生菌素及宁南霉素等在内的多种农用抗生素，其中由放线菌产生的春雷霉素以及由链霉菌产生的中生菌素、井冈霉素等抗生素已被广泛用于农作物病害的防治[2-3]。近年的研究发现，摩根菌科 (Morganellaceae) 的致病杆菌属 (Xenorhabdus) 和发光杆菌属 (Photorhabdus)细菌能够产生多种具有不同活性的次级代谢产物，这些次级代谢产物分别具有抑菌[4]、杀虫[5]、杀螨[6-7]、杀线虫[8]、抗溃疡[4]以及抗肿瘤[9]等活性。本文主要围绕致病杆菌属细菌代谢产物抑制真菌、细菌和卵菌的活性展开，综述了可产生抑菌活性物质的代表性菌株、所产生活性化合物的种类、活性化合物的抑菌作用机理、抑菌活性化合物的生物合成与调控、提高抑菌活性的方法、致病杆菌属细菌的实际应用及如何应对现阶段存在的问题等方面的内容，以期为促进致病杆菌属细菌在农业中的应用提供参考。

1 致病杆菌属细菌研究概况

致病杆菌属细菌是一类存在于昆虫病原线虫肠道内的共生菌，与斯氏线虫属 (Steinernema)的线虫共生，其模式菌株为嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila[10]。昆虫病原线虫共生菌存在于侵染期线虫的肠道中，可跟随线虫进入昆虫体内，在昆虫的血腔中大量繁殖，产生毒素和抑菌物质，与线虫共同作用杀死寄主昆虫，待寄主死后继续取食，直至营养耗尽，再跟随线虫寻找下一寄主[11]。嗜线虫致病杆菌具有两种生活形态，在添加了溴百里酚蓝和氯化三苯基四氮唑的营养琼脂培养基 (NBTA) 上，初生型菌株呈绿色(图1)，次生型呈近似暗红色，其具体颜色和培养条件存在一定的关系；初生型菌株能够产生具有抑菌活性的次级代谢产物，而次生型菌株则不能。

图1 嗜线虫致病杆菌YL001 初生型菌株在NBTA 培养基上的形态特征Fig. 1 Characteristics of primary phenotypic X.nematophila YL001 on NBTA medium

近几十年来，关于致病杆菌属细菌抑菌活性的研究备受瞩目。美国、德国、加拿大、澳大利亚、南非及土耳其等相继开展了一系列研究，其中，美国、加拿大和澳大利亚较早开始了其代谢产物抑菌活性的研究，德国主要致力于相关代谢物的生物合成及调控，南非和土耳其的研究涉及代谢物的分离与活性。国内则主要有西北农林科技大学、中国农业科学院、沈阳农业大学和河北农业大学等单位开展了相关研究。其中，中国农业科学院是国内最早进行昆虫病原线虫共生菌相关活性研究的单位，成功分离到了一些高活性的化合物，并初步探索了其抗细菌的作用机理[12-14]；西北农林科技大学较为系统地分离了嗜线虫致病杆菌的次级代谢产物，在一定程度上探索了次级代谢产物的抑菌作用机理，初步研究了相关代谢物的调控，并探索了发酵液的应用[15-19]；沈阳农业大学近些年开始大量分离昆虫病原线虫共生菌，并进行了代谢产物的分离研究[20-23]；河北农业大学主要研究了致病杆菌代谢物的杀虫作用，对其抑菌活性也有所涉及[24-25]；南开大学近年主要探索了利用致病杆菌代谢物防治土传病害的问题[26]。

2 致病杆菌属细菌代谢物的抑菌活性

2.1 可产生抑菌活性物质的致病杆菌属细菌

多种昆虫病原线虫共生菌都具有产生抑菌活性物质的能力。在已报道的文献 (见表1) 中，主要有伯氏致病杆菌X. bovienii、X. budapestensis、X. cabanillasii、X. doucetiae、X. khoisanae、嗜线虫致病杆菌X. nematophila、X. romanii和X.szentirmaii这8 种细菌的代谢物具有抑菌活性，其抑菌谱包括多种细菌、真菌和卵菌。值得注意的是，致病杆菌属细菌发酵液对卵菌的抑制效果尤为明显，抑菌率显著高于对真菌的。

表1 致病杆菌属细菌发酵液的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of the fermentation liquid of genus Xenorhabdus

2.2 具有抑菌活性的次级代谢产物

致病杆菌属细菌可产生多种具有抑菌活性的次级代谢产物，其中最值得研究的有以下几种化合物(图2 和图3)：Xenocoumacin 1 (Xcn1，1) 和PAX 系列抗菌肽，兼具抗卵菌、抗真菌和抗细菌活性；Nematophin (13)、Xenorxide 1 (24)、Xenorxide 2 (25) 和Xenofuranone B (62)，具有抗真菌和抗细菌活性；Xenorhabdin 2 (15) 和Odilorhabdin 衍生物，具有抗细菌活性。

图2 致病杆菌属细菌产生的抑菌活性化合物 (1～25)Fig. 2 Antimicrobial compounds (1-25) produced by genus Xenorhabdus

图3 致病杆菌属细菌产生的多肽类抑菌活性化合物 (26～54)Fig. 3 Polypeptide antimicrobial compounds (26-54) produced by genus Xenorhabdus

2.2.1 Xenocoumacin 类化合物 Xenocoumacin 类化合物 (1～6) 最早是从嗜线虫致病杆菌的代谢物中分离得到的，其主要代表为Xcn1，Xcn1 含有精氨酸残基和二氢异香豆素结构，Xcn2 (2) 碳链的末端不含胍基[4]。嗜线虫致病杆菌还可通过自身解毒作用分解Xcn1，在代谢过程中产生抑菌活性低于Xcn1 的5 种新化合物——Xcn2～Xcn6 (2～6)，通过改变菌株的培养条件，研究者成功检测到了Xcn3～Xcn6 (3～6)[34]。中国农业科学院是我国最早成功分离得到Xcn1 的单位，并发现了其优异的抗卵菌活性，Xcn1 对苎麻疫霉Phytophthora boehmeria和辣椒疫霉P. capsici的EC50值分别为0.25 和2.44 μg/mL[35]。西北农林科技大学的张淑静[36]也成功分离到了Xcn1，并发现了其在防治油菜菌核病中的作用，测得Xcn1 对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum的EC50值为3.0 μg/mL；此外，质量浓度为10.0 μg/mL 的Xcn1 对水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani、玉米大斑病菌Exserohilum turcicum和葡萄灰霉病菌Botrytis cinerea的抑制率均能达到80%以上[36]。总之，Xcn1 因其抑菌活性良好，具有开发成为农用杀菌剂的潜力。

2.2.2 吲哚类化合物 从致病杆菌属细菌代谢产物中分离到的一些吲哚类衍生物对多种细菌和真菌具有较好的抑制活性。在伯氏致病杆菌A2菌株的发酵液中发现了4 种吲哚类化合物 (7～10)，其中化合物7 和8 对新型隐球菌Cryptococcus neoformans的最低抑制浓度 (MIC) 值分别为50 和25 μg/mL，化合物9 和10 对灰霉病菌的MIC 值为12 μg/mL，化合物10 对致病疫霉Phytophthora infestans的MIC 值为50 μg/mL[37]。李凤麟等[38]在嗜线虫致病杆菌SN313 菌株的发酵液中发现了2 种吲哚类化合物，其中首次发现的化合物11 对辣椒疫霉的IC50值为11.20 μg/mL，化合物12 对番茄灰霉病菌的IC50值为41.58 μg/mL。Nematophin(NEP，13) 最早由Li 等[39]从嗜线虫致病杆菌BC1菌株的代谢产物中分离得到，能够抑制细菌、真菌和卵菌，NEP 对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的MIC 值为0.75 μg/mL，对枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、致病疫霉和灰霉病菌的MIC 值为12 μg/mL。Zhang 等[17]从嗜线虫致病杆菌YL001菌株的代谢产物中也分离得到了NEP，并测定了其农用抑菌活性，发现其对水稻纹枯病菌的EC50值为40.00 μg/mL，500 μg/mL 的NEP 对水稻纹枯病的治疗作用防效可达83.59%，与多菌灵的防效相当。综上可见，NEP 能够抑制多种病原菌，具有良好的应用前景。

2.2.3 二硫吡咯类化合物 从致病杆菌属细菌代谢物中发现的二硫吡咯类化合物主要包括Xenorhabdins 和Xenorxides 两类 (14～25)。在嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌的代谢物中都发现了Xenorhabdins (14～23) ，且这类化合物都具有抑菌活性。McInerney 等[40]在嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌的代谢物中发现了Xenorhabdin 1～Xenorhabdin 6 (14～19)，其中Xenorhabdin 2 (15)对滕黄微球菌Micrococcus luteus、化脓性链球菌Streptococcus pyogenes、蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus和金黄色葡萄球菌的MIC 值分别为0.156、1.25、3.13 和20 μg/mL，且其他几种化合物的抑菌谱与Xenorhabdin 2 类似。Li 等[37]在伯氏致病杆菌A2 菌株代谢物中首次发现了Xenorhabdin 7 (20)和Xenorhabdin 8 (21)。Xenorhabdin 9 (22) 和Xenorhabdin 10 (23) 则是沈阳农业大学的张文波等[22]从伯氏致病杆菌SN52 菌株代谢产物中发现的新化合物，这两种化合物对枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的IC50值在10～21 μg/mL 之间。

Chen[41]在伯氏致病杆菌的代谢物中发现了Xenorxide 类化合物 (24～25)，并发现其具有抗真菌和抗细菌活性。其中，Xenorxide 1 (24) 对烟曲霉Aspergillus fumigatus的MIC 值为0.75 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC 值为3 μg/mL。有趣的是，对于在临床上已产生多重抗药性的金黄色葡萄球菌菌株，Xenorxide 1 的MIC 值反而降低了4 倍；同样的现象也发生在Xenorxide 2 (25) 中，但Xenorxide 1 的抑菌效果强于Xenorxide 2，Xenorxide 2 对烟曲霉的MIC 值为1.5 μg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC 值为3 μg/mL，对于在临床上已产生多重抗药性的金黄色葡萄球菌菌株，其M I C 值降低了2 ～4 倍[41]。该结果表明，Xenorxides 或许可用于治理已产生抗药性的菌株。烟曲霉可引起食品腐烂，导致人和其他动物患病[42]，而Xenorxides 对烟曲霉效果较好，因此可考虑探索其在食品防腐中的应用。总之，无论在医学还是农业领域，致病杆菌属细菌产生的含硫吡咯烷类代谢物都具有一定的应用价值与开发潜力。

2.2.4 多肽类化合物 由致病杆菌属细菌产生的多肽类抗生素主要有5 大类，分别是Odilorhabdins(ODLs) 、Xenematides、Bicornutins、Peptideantimicrobial-Xenorhabdus (PAXs) 和Xenortides。多肽类抗生素的相对分子质量较大，如Xenematides和Bicornutins 的相对分子质量在600～1 000 之间，ODLs 和PAXs 在1 000 以上。

Xenortide A (26) 和Xenortide B (27) 最早由Lang 等[43]发现于嗜线虫致病杆菌的代谢物中，而Reimer 等[44]在嗜线虫致病杆菌的代谢物中发现了Xenortide C (28) 和Xenortide D (29)。Xenortides的4 个化合物都具有抗微生物活性。

Böszörményi 等[45]发现了Bicornutins (30～31)的抗卵菌活性，在25 μg/mL 时，Bicornutins 化合物的混合物几乎可完全抑制烟草疫霉Phytophthora nicotianae的孢子萌发。

PAXs 同时兼具抗真菌、抗卵菌和抗细菌活性。Gualtieri 等[46]从嗜线虫致病杆菌F1 菌株的代谢物中发现了PAX1～PAX5 (32～36)，在质量浓度为20 μg/mL 条件下，PAX1～PAX3 (32～34) 对枝孢霉属Cladosporiumsp.和黄色镰孢菌Fusarium culmorum的抑制率均能达到90%以上，20 μg/mL的PAX2 (33) 对疫霉Phytophthora myc的抑制率可达81%；PAX1～PAX3 对尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的抑制活性最强，其MIC 值为1.56 μg/mL，PAX4 (35) 对表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis的MIC 值为12.5 μg/mL，PAX5 (36)对大肠埃希菌和表皮葡萄球菌的MIC 值为12.5 μg/mL。Fuchs 等[47]在嗜线虫致病杆菌HGB081 菌株的代谢产物中发现了13 个PAXs 化合物 (32～44) 。Dreyer 等[31]首次在致病杆菌属的X. khoisanaeSB10 菌株代谢物中发现了PAXs 化合物，其中PAX1 对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和假丝酵母菌Candida albicans 均具有抑制作用。

目前已发现7 种Xenematides 化合物 (45～51)，这些化合物兼具医用和农用抑菌活性。美国哈佛大学医学院最早在嗜线虫致病杆菌ATCC19061 菌株的无细胞发酵液中发现了Xenematide A (45) ，之后又相继发现了Xenematide B (46)、Xenematide C (47) 和Xenematide D (48)[48-49]。卢星忠等[50]发发现了Xenematide E (49)，并测定了Xenematide C 和Xenematide E 对植物病原真菌的抑制作用，测得Xenematide C 和Xenematide E 对番茄灰霉病菌的EC50值分别为22.71 和85.31 μg/mL。Xi 等[51]发现了Xenematide F (50) 和Xenematide G (51)，并测定了其抑菌活性，其中Xenematide B 对枯草芽孢杆菌的MIC 值为64 μg/mL，Xenematide F 对绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和肠炎沙门菌Salmonella enteritidis的MIC 值分别为32 和64 μg/mL，Xenematide G 的抑菌活性最好，对枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC 值为16 μg/mL。

Odilorhabdin 类 (ODLs) 化合物最早是由美国学者发现的。Pantel 等[52]在嗜线虫致病杆菌CNCM I-4 530 菌株的代谢物中发现了一类新的多肽类抗生素 (52～54)，分别将其命名为NOSO-95A(52)、NOSO-95B (53) 和NOSO-95C (54)，这类抗生素能够抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，也包括已对碳青霉烯类抗生素产生抗性的肠杆菌科细菌。 Pantel 等[52]研究发现，ODLs 的衍生物NOSO-95179 对肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae的抑制活性最强，其MIC 值为4 μg/mL，对粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和大肠埃希菌Escherichia coli的MIC值为8 μg/mL[52]。ODLs 及其衍生物抑菌活性好且对抗药性菌株有效，在医学领域有着较好的开发应用前景，但有关ODLs的农用抑菌活性目前还未见明确报道。

综上可见，多肽类化合物种类较多，结构变化多样，大多兼具农用和医用活性，其中PAXs的农用活性较为突出，ODLs 的医用潜力较大。

2.2.5 酰胺类化合物 因其长链上含有酰胺结构，有学者也将吲哚类衍生物NEP 归为酰胺类化合物。刘霞[53]从嗜线虫致病杆菌YL001 的发酵液中发现了几种酰胺类化合物 (55～57，图4) ，并发现这几种化合物对番茄灰霉病菌均有一定的抑制活性。Zhang 等[17]在嗜线虫致病杆菌YL001 菌株发酵液的石油醚萃取物中发现了化合物58，其在50 μg/mL 下对玉米大斑病菌的抑制率为67.70%[17]；同时在该菌株发酵液的乙酸乙酯萃取物中还发现了化合物59，但该化合物的抑菌活性较弱。张春珍等[23]在伯氏致病杆菌SN269 菌株的发酵液中发现了化合物Madumycin Ⅱ (60)，该化合物具有抗真菌活性，对番茄灰霉病菌、辣椒疫霉及玉米大斑病菌的EC50值分别为35.40、35.32 和47.43 μg/mL。酰胺类化合物结构多样，相对分子质量较小，便于化学合成，因此对这些具有抑菌活性的天然产物进行合理的结构改造将有助于拓宽其应用范围。

图4 致病杆菌属细菌产生的酰胺类及其他抑菌活性化合物 (55～64)Fig. 4 Amides and others antimicrobial compounds (55-64) produced by genus Xenorhabdus

2.2.6 其他类型化合物 Ji 等[54]在嗜线虫致病杆菌代谢物中发现的Benzylidenacetone (61)具有一定的抑菌活性，能够抑制冠瘿病菌Agrobacterium vitis、胡萝卜软腐病菌Pectobacterium carotovorum及茄科青枯病菌Ralstonia solanacearum等多种植物病原细菌，但在质量浓度为链霉素4 倍的情况下，其抑菌活性仍低于对照链霉素，因此该化合物在农业领域的应用前景不大。

致病杆菌属细菌还能够产生具呋喃酮结构的抑菌活性化合物，这类化合物最早由Brachmann等[55]从X. szentirmaii菌株的代谢物中分离得到。Xenofuranone A (62) 和Xenofuranone B (63) 对铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、粪肠球菌Enterococcus faecalis、假丝酵母菌和大肠杆菌均具有一定的抑制活性[55-56]。此外，Xenofuranone B 对金黄色葡萄球菌和假丝酵母菌的MIC 值分别为64 和2 μg/mL[57]。针对Xenofuranone A 和Xenofuranone B 的农用活性目前暂无相关报道，研究者可尝试测定其对植物病原菌的抑制作用。因其对假丝酵母菌的抑制活性较好，Xenofuranone B 具有开发成为医药的潜力。

2018 年，西北农林科技大学的刘启[58]和沈阳农业大学的李凤麟等[38]分别在嗜线虫致病杆菌YL001 菌株和SN313 菌株的发酵液中发现了申嗪霉素 (64) 。传统的申嗪霉素是从假单胞菌属(Pseudomonads) 的代谢物中分离得到的[59]，嗜线虫致病杆菌为天然申嗪霉素生产提供了新的来源。

综上，致病杆菌属细菌能够产生多种具有抑菌活性的次级代谢产物，其中研究最多的是嗜线虫致病杆菌，其次是伯氏致病杆菌。一些抑菌活性化合物 (如 Xenorhabdins) 在嗜线虫致病杆菌和伯氏致病杆菌的代谢物中都能够被发现，这是由于这两种菌的生物学关系较近，由此推测其他化合物也应当可以在生物学关系相近的菌株中被发现，但还需进一步研究。关于从细菌的代谢物中分离获取单一化合物目前还没有统一的方法，获得所需化合物存在一定的难度，因此其他人不易开展相关研究，一般都是某个课题组发现一种或几种活性化合物后，团队自己再进行后续研究。仅少数化合物如Xcn1 等，由于抑菌活性好、发现时间较早、抑菌谱较广等原因研究相对较多。总之，新活性与新化合物的发现依然极为重要。

3 抑菌活性化合物的作用机理

致病杆菌属细菌代谢产物中具有抑菌活性的化合物种类较多，其作用机理也存在差异。相关研究表明，一些来源于致病杆菌属细菌的天然产物能够抑制蛋白质的合成，但不同化合物抑制蛋白质合成过程中的具体步骤存在些许差异。如Xcn1可能是通过与精氨酰tRNA 结合来抑制肽链的延伸，ODLs 衍生物NOSO-95179 通过增加tRNA 与核糖体的亲和力而抑制翻译过程的起始阶段，而Madumycin II 则通过阻止tRNA 的CCA 末端与肽基转移酶中心结合而抑制第一个肽键的形成。

3.1 Xenocoumacin 1 的作用机理

现有研究表明，Xenocoumacin 类化合物中以Xcn1 的抑菌活性最强，且其作用机理主要在影响蛋白质合成方面。Xcn1 对疫霉 (Phytophthora)的活性最强，可影响辣椒疫霉孢子囊形成、游动孢子萌发和菌丝生长，并可引起菌丝发生明显的形态变化[60]。Zhou 等[14]研究发现，Xcn1 可引起与氨基酸合成、物质转运及氨酰tRNA 合成等相关基因的下调。张淑静[36]发现，Xcn1 可引起油菜菌核病菌的菌丝畸形及细胞内部结构紊乱，通过分子对接发现，Xcn1 能够与精氨酰-tRNA 合成酶上的4 个氨基酸残基形成氢键，从而抑制精氨酰-tRNA 合成酶的活性。灭瘟素 (Blasticidin S) 具有与Xcn1 相似的长链结构，且二者长链末端都含有胍基，其作用机理在于通过抑制携带多肽的tRNA 的水解，使得新合成的肽链片段无法释放，即抑制翻译过程的终止阶段[61-62]。Polikanov等[63]在短小芽孢杆菌Bacillus pumilus中发现的Amicoumacin A (AMI) 与Xcn1 的结构也极为相似，其能够结合到核糖体上，通过稳定mRNA-核糖体的相互作用而影响翻译的延伸过程。Zumbrunn 等[64]指出，Xcn1 的作用机理和AMI 相同，但目前尚无法充分证明，因为AMI 的长链结构可与16S rRNA 和mRNA 结合形成氢键，而Xcn1 的碳链比AMI 长，可能会影响其进入16S rRNA 和mRNA 之间的空腔中，此外，二者的相同结构苯并吡喃环在抑制翻译的过程并未显示出作用。综上，Xcn1 的长链结构和胍基结构可能在影响蛋白质翻译的过程中发挥着重要作用，但Xcn1 具体如何影响蛋白质的翻译仍需进一步确定。

3.2 Nematophin 的作用机理

Zhang 等[17]研究发现，NEP 能够引起水稻纹枯病菌菌丝表面皱缩、菌丝体畸形、细胞器显著受损以及线粒体数量明显减少，此外还能够显著减少水稻纹枯病菌菌核的产生，但上述影响并无剂量效应。现有研究仅显示了NEP 抑菌作用的表观机理，其分子机理仍需进一步研究。

3.3 Odilorhabdin 类化合物的作用机理

Odilorhabdin 类 (ODLs) 化合物主要通过作用于核糖体而抑制蛋白质的合成，且与四环素和链霉素的作用机理显著不同。Pantel 等[52]通过冷冻电镜研究发现，ODLs衍生物NOSO-95179 作用于核糖体解码中心的A位点，并与16S rRNA 残基形成多重氢键，增加氨酰-tRNA 与核糖体的亲和力，使核糖体不能释放，从而抑制翻译过程的起始阶段。

3.4 Madumycin II 的作用机理

Madumycin II 可结合到70S 核糖体的大亚基上，迫使肽基转移酶中心进入非活性状态，进而抑制肽键的形成。Osterman 等[65]研究发现，在Madumycin II 浓度为3.2 μmol/L 条件下，甲硫氨酸-苯丙氨酸二肽的形成率降低至40%；当该化合物浓度为5 μmol/L 时，甲硫氨酸-苯丙氨酸二肽的形成率仅为10%左右。在肽键形成的第一周期之前，Madumycin II 即可结合到核糖体上，其虽然不会影响tRNA 与核糖体A 和P 位点的结合，但能够阻止tRNA 的CCA 末端正确定位到肽基转移酶中，导致tRNA 携带的甲硫氨酸无法与下一个氨基酸之间形成肽键，使蛋白质无法正常合成[65]。

4 抑菌活性化合物的生物合成与调控

致病杆菌属细菌的次级代谢产物中，关于Xcn1、NEP、OLDs 和Xenematides 的生物合成研究较多，由于申嗪霉素最早不是在致病杆菌代谢物中发现的，故本文不再涉及。Xcn1 的结构较为复杂，且是通过先生成无活性的前体物质再裂解为Xcn1 的过程得到的，故有别于其他活性化合物。上述几种化合物中，关于Xcn1 代谢调控方面的研究较多，对NEP、OLDs 和Xenematides 代谢调控的研究较少，其中NEP 的生物合成途径较为简单，因此OLDs 和Xenematides 的代谢调控将是一个重要的研究方向。近年的研究揭示了一种新型调控因子在天然产物生物合成中的作用，认为一种依赖于调控蛋白Hfq 的名为ArcZ 的小RNA是产生某些特定天然产物所必需的[66]。这类新型调控因子的发现将有助于提高某些天然产物的含量。

4.1 Xenocoumacin 类化合物的生物合成与调控

非核糖体肽合成酶 (NRPS) 和聚酮合成酶(PKS) 参与了Xcn1 的生物合成。Xcn1 的生物合成与转化共涉及14 个基因，分别为xcnA、xcnB、xcnC、xcnD、xcnE、xcnF、xcnG、xcnH、xcnI、xcnJ、xcnK、xcnL、xcnM和xcnN，其中xcnA～xcnL基因负责Xcn1 的生物合成，xcnM和xcnN负责Xcn1 向Xcn2 的转化[67]。XcnA 和XcnK 为非核糖体肽合成酶，XcnF、XcnH 和XcnL 为聚酮合酶[68]。嗜线虫致病杆菌在细胞质中先按照XcnA→XcnH→XcnK→XcnL→XcnF 的催化顺序合成没有活性的前体物质，随后XcnG 催化裂解Xcn1 前体上酰基化的天冬酰胺残基而形成有活性的Xcn1，最后被ABC 转运蛋白转运到细胞外[69]。

具有抑菌活性的Xcn1 对嗜线虫致病杆菌自身也有一定的毒性，若其积累过高会引起xcnM和xcnN的大量表达，导致Xcn1 转化为活性较低的Xcn2，且Xcn1 和Xcn2 还可以分别转化为Xcn5 和Xcn6[34]。当环境中碱性过强时，Xcn1 中呈弱碱性的长链胍基会被分解，因此，发酵液的pH 值对Xcn1 的代谢调控具有很重要的影响。研究显示，在接近中性的条件下，嗜线虫致病杆菌发酵液的抑菌活性将得到增强，其菌株生长和产生抑菌活性物质的最适pH 值在6.5～7.5 之间[70]。在5.5～8.5 范围内，当pH 值逐渐升高时，xcnA～xcnL基因的表达量随之升高，从而促进Xcn1 的生物合成，使得Xcn1 的产量得到较大幅度提升[15]。此外，李忝珍等[71]研究发现，低浓度的NaCl 有利于嗜线虫致病杆菌YL001 菌株的生长以及Xcn1的生物合成。

双组分调控系统中的OmpR 和CpxR 可负向调控Xcn1 的合成，敲除cpxR基因后，嗜线虫致病杆菌发酵液的抑菌活性可提高1.4～1.7 倍[18]，而在ompR基因缺失的突变体中，xcnA～xcnL基因的表达量上调，抑菌活性得到提高[67]。全局转录调控因子Lrp 和FliZ 可正向调控Xcn1 的生物合成，LeuO 则负向调控Xcn1 的生物合成[72-73]。然而，通过操控这几种调控因子虽然能够显著提高Xcn1 的产量，但仍无法达到大量应用的要求，因此还需要继续深入研究Xcn1 的调控机制。

4.2 Nematophin 的生物合成

NEP 的化学结构较为简单，通过异源表达的方式已经明确其生物合成途径，NEP 的生物合成是由一种名为RdpD 的非核糖体肽合成酶完成的，不存在多个重复的模块[74]。目前尚未见关于调控NEP 生物合成的相关报道。因其结构较为简单，Wesche 等[75]采用化学方法合成了NEP 及其类似物，但NEP 衍生物的抑菌活性相比母体而言有所降低。此外，Zhang 等[17]发现，化学合成所得同时含有两种构型的NEP 和从发酵液中分离得到的NEP 在抑菌活性上并无显著性差异，这也说明了天然产物NEP 可能是两种构型的混合物。

4.3 Odilorhabdin 类化合物的生物合成

Odilorhabdin 类化合物的生物合成由odl1、odl2、odl3和odl44 个编码基因控制，含有m1～m10 共10 个模块，包含有缩合结构域 (C)、腺苷酰化结构域 (A) 和肽酰载体蛋白 (T)，在m10 模块的后面存在一个硫酯酶结构域 (TE)，该结构域负责终止肽链的延伸[52]。

4.4 Xenematide 类化合物的生物合成

非核糖体肽合成酶负责Xenematide 类化合物的生物合成，与OLDs 的生物合成相比，Xenematide类化合物由4 个CAT 模块组成，并在最末端含有一个TE 模块[49]。

5 存在的问题与对策

5.1 如何提高杀菌活性以及活性化合物的产量

尽管致病杆菌属细菌的代谢物中包含多种抑菌活性较好的化合物，但产率较低仍是限制其进一步开发利用的重要因素。为促进其更好地应用，一方面可以采用化学方法合成这些活性化合物，另一方面就是采取适当的策略以提高菌株代谢物中活性化合物的产量。相关策略包括发酵工艺优化、操控调控因子、操控启动子及操控关键酶等手段。

采用化学合成的方法合成一些天然产物及其相关衍生物，能够提高这些天然产物的应用潜力，但其衍生物并非总能提高抑菌活性。例如，OLDs 的衍生物中出现了活性更高的化合物[52]，申嗪霉素的衍生物中也出现了一些高活性化合物[76]，但Xcn1 的多种衍生物的抑菌活性却均不如母体[64]，NEP 衍生物的抑菌活性也不如母体[75]。

菌株类型、营养物质及环境条件等都会影响微生物代谢物的种类和含量，因此通过发酵工艺的优化能够提高一些抑菌活性物质的产量。NEP的产量与菌株种类有关，嗜线虫致病杆菌BC1 菌株的NEP 产量显著高于ATCC19061 菌株和D1 菌株[39]；Xcn1的产量也与菌株的种类有关，比如嗜线虫致病杆菌 All 菌株的Xcn1 产量明显高于 YL001菌株[19]。此外，Xcn1 和NEP 都能在48 h 时达到最高产量，并在后续表现出产量下降趋势[19,39]。张易等[77]采用紫外、微波处理等方法对嗜线虫致病杆菌CB6 菌株进行诱变，筛选到了能够提高Xcn1产量的菌株，但提高量只有10%左右。魏明敏[78]通过对嗜线虫致病杆菌CB6 菌株的发酵过程进行优化，将发酵液中Xcn1 的产量从146 μg/mL 提高到了312 μg/mL，但由于该研究中是通过建立抑菌圈大小与浓度关系的标准曲线来评价发酵液中Xcn1 的含量，试验误差较大，因此其结果的有效性仍需进一步评价。Dong 等[32]采用原位产物转移的办法提高Xcn1 的产量，该方法最大优势在于减少了Xcn1 的代谢降解。该研究与魏明敏[78]采用的是同一菌株，但是Xcn1的产量并未达到魏明敏研究中所提及的产量，因此，以抑菌圈大小评价化合物含量的方法并不够精确。高江涛[19]对嗜线虫致病杆菌YL001菌株的发酵过程进行了优化，发酵液中Xcn1 的产量最高可达170 μg/mL。该研究采用高效液相色谱法检测Xcn1 的含量，是检测单一化合物含量的一种较为可靠的方法，因此其结果更为可靠。以嗜线虫致病杆菌YL001 菌株为研究对象，陕西省生物农药工程技术研究中心进行了多项相关研究，发现了不同培养基、pH 值、渗透压、通氧模式及其他发酵条件对抑菌活性物质产量的影响[15,71,79-81]，但是，这些方法对化合物产量的提高仍然是有限的，目前来看并不能达到生产应用所需要的水平。

现代分子生物学技术的发展为提高天然产物的产量提供了可能，基因敲除、异源表达、过表达、启动子交换与激活等各种遗传操控手段均可用于提高微生物的一些特定代谢物的产量。定向敲除负调控基因可以提高微生物代谢物的产量。在嗜线虫致病杆菌YL001 菌株中，双组分调控系统CpxA/CpxR 中的CpxR 能够负调控xcnA～xcnL基因，敲除cpxR基因后，Xcn1 的产量可提高至3 倍以上[18]。双组分调控因子OmpR 和全局调节因子LeuO 负调控Xcn1 的生物合成，而全局调节因子FliZ 和Lrp 正调控Xcn1 的生物合成[72-73]。因此，如果能将几个负调控基因敲除，并使正调控基因过表达，则Xcn1 的产量很可能会得到较大的提升。Liu 等[82]将Holrhizin A 和Rhizoxins 在短叶石勒菌Schlegelella brevitalea中进行异源表达后，其产量得到了显著的提高。此外，将嗜线虫致病杆菌的lrp基因采用阿拉伯糖诱导型启动子过表达后发现，Xcn1、Xenematide A 和Rhabdopeptide 1 等几个化合物的产量都得到了显著的提高[83]。启动子激活的方法可用于定向生产某种代谢产物，该方法省去了大量的纯化步骤，减少了分离过程中化合物的损耗，因此可视为提高特定代谢物产量的一种有效的方法[83]。

此外，酶工程学和合成生物学的发展为提高特定天然产物的产量提供了新方法。Bozhüyük 等[84]在NRPS 的缩合结构域中发现了一种交换单元缩合结构域 (XUC)，该结构域能够产生高含量的非核糖体肽，且比化学合成的方法更加环保，其中一些人造肽的含量可达到280 mg/L。Liu 等[82]通过改造底盘菌株，发现了一批能够提高异源表达时天然产物相对产量的高效底盘菌株，例如在短叶石勒菌的一些突变株中，Rhizomide A 和Icosalise A1 等几种化合物的产量显著提高。因此，将致病杆菌属细菌代谢物中高活性化合物的生物合成基因簇在短叶石勒菌中进行表达，也是提高抑菌活性化合物产量的一种可行的方法。

5.2 发掘新化合物

微生物产生的代谢产物多种多样，我们不一定能够分离出所有的活性物质，因此，如何发掘新化合物依然是嗜线虫致病杆菌研究中存在的问题。除了传统的分离手段外，一些新技术，如微生物共培养、异源表达、基因敲除、改造启动子以及改造关键酶等也可用于协助发掘新的致病杆菌活性代谢产物。

微生物共培养技术可用于发掘新的微生物次级代谢产物。跨物种共培养系统创造了接近自然环境的状态，促进了共培养微生物之间的相互作用，从而有可能激活一些天然产物的生物合成[85]。采用共培养技术，在海洋微生物的代谢物中已经发现了多种新化合物，对一些真菌也能通过模块化共培养工程发现新的天然产物[86-87]。将曲霉Aspergillus sydowii和枯草芽孢杆菌共培养，目前已发现25 种新代谢物，其中有4 种是新化合物[88]。因此，对致病杆菌属的细菌也可考虑采用共培养技术来促进新型天然产物的发现。

将特定基因簇进行异源表达也能够发现新的化合物，这一方法已在致病杆菌属细菌天然产物发掘中得到应用。通过将抗菌肽Xenortide 的生物合成基因簇kj12ABC异源表达至大肠杆菌中，发现了7 种含有甲硫氨酸的新型肽类化合物，且这类新化合物表现出了与原有化合物不同的生物活性[89-90]。Crawford 等[91]已成功将嗜线虫致病杆菌产生的Rhabduscin 在大肠埃希菌中进行表达，致病杆菌属细菌产生的其他天然产物也可参照此方法进行新化合物的发掘。

挖掘隐藏的生物合成基因簇有助于新化合物的发现。Liu 等[92]通过基因组挖掘和异源表达的方法，发现了一系列结构新颖的大环内酯类化合物。Liu 等[82]将几丁质单胞菌Chitinimonas koreensis中不表达的生物合成基因簇chm在短叶石勒菌突变株中异源表达，发现了一系列新型天然产物chitinimides A～chitinimides H。通过基因组分析发现，嗜线虫致病杆菌YL001 菌株含有多种天然产物的生物合成基因簇，但是目前并不能分离到相对应的所有化合物[36]，而将这些生物合成基因簇在短叶石勒菌突变株中异源表达，或许能发现一些新的化合物。

过表达某些基因也可促进新化合物的发现。将嗜线虫致病杆菌的leuO基因在X. szentirmaii菌株中过表达后，不仅发现了一些已知结构但之前未被发现的化合物，还发现了一些具有新结构的化合物[72]。此外，定向敲除某个基因也可能得到新的化合物。将构巢曲霉Aspergillus nidulans中全局调节因子LaeB 的基因敲除后，发现了8 种之前在其代谢物中未发现过的化合物，其中4 种是新化合物[93]。

插入启动子激活沉默的基因簇也可得到一些之前未被发现的代谢物。目前这一方法已在唐菖蒲伯克霍尔德菌Burkholderia gladioli中得到应用，通过激活其bgdd和hgdd基因簇，发现了一些新的脂肽类化合物[94]。启动子激活技术也可用于帮助发掘新化合物，例如缺失hfq基因的X.szentirmaii菌株本身不能产生任何已知的天然产物，但使用阿拉伯糖诱导型启动子激活hfq突变株中相应的生物合成基因簇后，可以使发酵液中只产生相应的化合物，而无其他次级代谢产物的干扰，便于对特定化合物甚至是新化合物的分离和检测[83]。

采用酶工程学的方法对非核糖体肽合成酶进行设计，也有助于新化合物的发现。Bozhüyük 等[95]通过对非核糖体肽合成途径中不同模块的可交换单元 (XUs) 进行拼接改造，建立了新型非核糖体肽合成酶，从而发现了一系列新化合物。该研究中的一部分XUs 即来自于致病杆菌属细菌，因此，该方法有助于致病杆菌属细菌代谢物中新化合物的发现。对NRPS 缩合结构域中的XUC 结构域进行重新编程，能够产生包含非天然氨基酸的新型肽类化合物，这也有助于发现有活性的新型天然产物[84]。Zhong 等[96]通过对几种多肽的起始缩合结构域进行修饰，将乙酰基链延长至十六烷酰基，从而生成了由特定酰基链组成的新化合物。

5.3 现阶段如何科学合理利用致病杆菌属细菌

针对同一菌株，不同人不同时期按相同的分离流程进行试验，不一定能分离得到相同的化合物，而采用不同的分离方法却有可能分离出同一化合物，由此可见，以分离得到的单一化合物纯品进行应用研究显得捉襟见肘，因此，利用分离过程中的半成品、粗制品以及直接利用发酵液是解决现阶段致病杆菌属细菌应用问题的一个可行办法。通过发酵工艺优化可以提高发酵液的抑菌活性，高活性的发酵液可以直接应用到生产实际中。此外，采用一些工艺进行浓缩，提高发酵液中有效成分的含量并将其配成制剂也能够解决嗜线虫致病杆菌的应用难题。目前，嗜线虫致病杆菌中的高活性化合物Xcn1 是此类细菌代谢物作为农用制剂开发的热点。石延霞等[97]通过盆栽和小区药效试验发现，0.25%的Xcn1 水剂对黄瓜白粉病防效明显，其40 倍液施用7 d 后防效可达98.30%。高江涛[19]研制的1.2% Xcn1 水剂对油菜菌核病具有较好的防治效果。本课题组通过对发酵液进行除糖、浓缩等预处理以提高母液中Xcn1 的含量，配制了一系列制剂，在防治苹果轮纹病、苹果腐烂病和猕猴桃溃疡病的离体枝条试验中显示出了良好的效果，且在防治猕猴桃溃疡病的田间药效试验中取得了显著的效果 (未发表)。

总之，启动子激活的方法已成功用于Xcn1 的生产，为获得高纯度或高含量的Xcn1 产品提供了一条可行的道路。Incedayi 等[7]使用阿拉伯糖诱导型启动子激活Xcn1 的生物合成基因簇，获得了含有高纯度Xcn1 的发酵液。同时，酶工程学方法也可用于生产较高纯度的特定化合物，在非核糖体肽合成过程中，对XUC 结构域进行重新编程可用于生产副产物较少的特定化合物，以简化特定化合物的纯化步骤[84]。

6 结语与展望

发现具有活性的菌株及化合物是致病杆菌属抑菌活性研究的重要基础。本文列举了其中可产生抑菌活性物质的代表性菌株，较为全面地总结了近几十年来在致病杆菌属细菌代谢物中发现的抑菌活性化合物，并对其中部分抑菌活性化合物的抑菌作用机理进行了讨论，认为影响蛋白质合成是多数化合物发挥抑菌作用的重要途径。同时，基于抑菌活性化合物的生物合成途径及相关调控因子，总结了从致病杆菌属细菌代谢物中发掘新化合物和提高活性化合物产量的方法，以期为致病杆菌属细菌活性代谢物的科学合理应用提供参考。此外，本文还介绍了几种来自于嗜线虫致病杆菌主要抑菌活性化合物Xcn1的制剂。

在国家 “化肥农药减量增效” 等相关政策的引导下，生物农药将拥有更广阔的应用前景，致病杆菌抑菌活性代谢物的研究应用也有望得到进一步发展。笔者认为，未来致病杆菌属细菌抑菌活性代谢物的研究将在以下5 个方向有所突破：1) 以提高特定代谢物产量为目标的遗传操控研究；2) 以治理抗药性为目标的作用机理研究；3) 以发现新化合物为目标的天然产物分离研究；4) 以直接利用为目标的相关产品开发研究；5) 以拓宽其应用范围为目标的新活性筛选研究。

以提高高活性化合物产量为目标的研究应是当下的重要研究方向，不仅可以研究多种调控因子对活性化合物的调节，深入探讨各种调控因子发挥作用的分子机理，还可以对特定生物合成基因簇中的关键酶进行改造。目前德国法兰克福歌德大学的Bode 课题组在该领域研究较为深入，他们解析了Xcn1[67]、NEP[74]和Xenortides[44]等化合物的生物合成过程，发现了一些新型调控因子[66]，并通过引入诱导型启动子激活特定的生物合成基因簇，提高了特定化合物的产量[83]。以俄罗斯和美国研究者为代表进行的作用机理研究，揭示了一些细菌代谢物类抗生素抑制蛋白质合成的分子机理[52,63]。相信随着冷冻电镜技术的普及，抗生素发挥抑菌活性的分子机理将得到更为清晰明确的阐述。

随着致病杆菌属细菌代谢物中的活性化合物不断被发现，在发酵液中寻找新型化合物的难度越来越大。微生物共培养和分子水平的遗传操控为发掘新化合物提供了新思路。同时，探索抑菌化合物的其他生物活性将是一个可行的方向，且目前已取得一定的进展。以Xcn1 为例，最早发现它是因为其优异的抑菌活性[4]，近年的研究又发现了其显著的杀螨活性。Incedayi等[7]发现，用药48 h 后，Xcn1 对二斑叶螨Tetranychus urticae的LC50值为60 μg/mL，但其田间试验效果还有待评价。Xenorxide 1 和Xenorxide 2 两种化合物已被发现可用于食品防腐和医药开发，进一步提高了致病杆菌的应用价值。目前针对致病杆菌相关产品的研发仍集中于单一活性化合物为主体的研究，倘若能够集中更多的有效成分联合进行产品开发，将多种活性成分协同作用，有望延缓抗药性的产生，延长相关制剂的使用周期。