噁唑菌酮与精甲霜灵复配对葡萄霜霉病的防效及药剂在葡萄中的残留

夏丽娟, 卿尚飞, 苏正川, 杨惠玲

(1. 四川省农药检定所，成都 610041；2. 四川海润作物科学技术有限公司，四川 夹江 614100)

葡萄霜霉病属于世界性葡萄病害[1]，也是我国葡萄生产上的主要病害，其病原菌葡萄生单轴霉Plasmopara viticola(Berk.et Curtis) Berl.et de Toni是一种专性寄生卵菌[2]，主要为害叶片，也可侵染新梢、幼果等幼嫩组织，在多雨潮湿的气候条件下极易发生[3]。一般可造成葡萄减产20%～30%，当条件适宜时，该病传播迅速，一旦流行甚至可能造成葡萄绝收，严重制约葡萄产业发展[4]，且因具有反复侵染、繁殖率高的特点，防治较困难[5]。

目前生产上对葡萄霜霉病仍以化学药剂防治为主，常用药剂主要有甲氧基丙烯酸酯类及羧酸酰胺类等[1]。由于长期使用作用位点单一的农药，目前已出现抗药性问题，导致防效下降[6]。研究开发高效广谱型新杀菌剂，或将不同作用机理的药剂复配使用，可有效延缓病原菌抗药性的产生，提高杀菌活性、减少用药量及降低使用成本。噁唑菌酮 (famoxadone) 属于能量抑制剂类，通过抑制病原菌线粒体的电子传递，使其无法产生所必需的能量而达到杀菌目的[7]。精甲霜灵 (metalaxyl-M) 是具有立体旋光活性的杀菌剂[8]，具有很强的内吸性和双向传导性，对疫霉和腐霉等卵菌所致病害防效好，在土壤中降解速度快[9]。目前已有将精甲霜灵应用于葡萄上病害防治的研究，但单剂施用次数多，用药量较大[10]。目前尚未见噁唑菌酮单剂用于葡萄上的报道，更未见有关噁唑菌酮和精甲霜灵复配防治葡萄霜霉病及在葡萄上残留的研究报道。为此，笔者研究了两种药剂复配对葡萄霜霉病菌的联合毒力，并在此基础上验证了其质量比1∶1 的复配制剂30% 噁唑菌酮 · 精甲霜灵悬浮剂对葡萄霜霉病的田间防效及药剂在葡萄中的残留行为，以期为噁唑菌酮和精甲霜灵复配防治葡萄霜霉病及在葡萄上的安全使用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 室内生物活性测定

1.1.1 供试菌株、药剂及主要仪器设备 葡萄生单轴霉Plasmopara viticola(Berk. et Curtis) Berl. et de Toni 由四川农业大学提供，于4 ℃低温处理15 min 后备用[6]。

噁唑菌酮 (famoxadone) 标准品 (纯度98%，Toronto Research Chemicals Inc.)；精甲霜灵(metalaxyl-M) 标准品 (纯度99.3%，上海市农药研究所有限公司)；95% 噁唑菌酮原药、93%精甲霜灵原药和30% 噁唑菌酮 · 精甲霜灵 (噁唑菌酮和精甲霜灵质量比1 : 1) 悬浮剂 (SC) (均由四川海润作物科学技术有限公司提供)；对照药剂68.75% 噁唑 · 锰锌水分散粒剂 (famoxadone + mancozeb，WG) (美国杜邦公司)，68%精甲霜灵 · 锰锌水分散粒剂 (metalaxyl-M + mancozeb，WG) (瑞士先正达作物保护有限公司)；丙酮 (分析纯)，吐温-80(化学纯) 。

Agilent 6430 液相色谱-质谱联用仪 (LCMS/MS) 及Agilent Poroshell 120EC-C18液相色谱柱 (安捷伦科技有限公司)；MTV-100 多管旋涡混合仪 (杭州奥盛仪器有限公司)；ULTRA-TURRAXT 25 匀浆机 (德国IKA 公司)；Y-4 水浴恒温振荡器(江苏金坛金城国胜试验仪器厂)；WS-16 型背负式喷雾器 (山东卫士植保机械有限公司)。

1.1.2 噁唑菌酮与精甲霜灵联合毒力测定 按盆栽法[11]测定两种药剂的联合毒力效果。葡萄品种为 ‘红提’。用丙酮将精甲霜灵和噁唑菌酮原药分别稀释为1.0 × 104mg/L 的母液，再用质量分数为0.1%的吐温-80 水溶液将母液稀释成7 个系列质量浓度。其中，精甲霜灵和噁唑菌酮为0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L；精甲霜灵∶噁唑菌酮[4 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 4 (质量比，全文同) ]为0.4、0.8、1.5、3.0、6.0、12.0 和24.0 mg/L。将上述系列质量浓度药液分别喷雾至葡萄叶片全部润湿，每个浓度设4 次重复，每个重复3 株葡萄，以喷施含有等量0.1%吐温-80 的水溶液为对照，自然晾干，备用。将保存的葡萄霜霉病菌于20 ℃黑暗保湿培养24 h，促使新鲜孢子囊产生，制成浓度为1 × 105～1 × 107个/mL 的孢子悬浮液。将孢子悬浮液喷雾至药剂处理后24 h 的葡萄叶面，置于日光温室内保湿培养14 d，待空白对照组病叶率达到80%左右时分级调查各处理的发病情况。

根据调查数据，计算各处理的病情指数和防治效果。按浓度对数-防治效果几率值分析(Bliss)法，采用DPS13.0 软件处理数据，计算毒力回归方程、相关系数、EC50、EC90及95%置信限。采用孙云沛[11]提出的方法，根据共毒系数(CTC)评价混剂的联合毒力：CTC≤80 为拮抗作用；80＜CTC＜120 为相加作用；CTC≥120 为增效作用。计算公式详见式 (1)、(2) 和 (3)。

式中：ATI 为混剂的实测毒力指数；S 为标准药剂的EC50值， mg/L；M 为混剂的EC50值，mg/L；TTI 为混剂的理论毒力指数；TIA为A 药剂EC50值与混剂EC50值的比值；PA为A 药剂在混剂中的百分含量，%；TIB为B 药剂EC50值与混剂EC50值的比值；PB为B 药剂在混剂中的百分含量，%；CTC 为共毒系数。

1.2 田间药效试验

田间试验分别在四川省丹棱县丹棱镇及北京市昌平区阳坊镇葡萄园中进行，品种分别为 ‘巨峰’ 和 ‘黑宝石’。‘巨峰’ 葡萄为7 年树龄，栽培规格2.4 m × 1.0 m；‘黑宝石’ 葡萄为6 年树龄，栽培规格3.2 m × 1.2 m。施药时葡萄处于果实膨大期，霜霉病发病前期。

施药剂量 (有效成分) ：30% 噁唑菌酮 · 精甲霜灵SC 分别为120、150、200 mg/kg；对照药剂68.75% 噁唑 · 锰锌WG 为687.5 mg/kg，68%精甲霜灵 · 锰锌WG 为1 360 mg/kg；并设清水对照。于葡萄霜霉病初发期第1 次施药，共施药3 次，间隔期7 d。每处理4 次重复，每重复6 株葡萄，随机区组排列。

分别于第3 次施药后7 d 和14 d 调查葡萄霜霉病发病情况[12]，按式 (4) 和 (5)分别计算病情指数及防治效果。用DPS 13.0 软件进行单因素方差分析，采用DMRT 法进行差异显著性检验。

式中：DI 为病情指数；DN为各级病叶数；GN为对应级数；DT为调查总叶数；CE 为防治效果；DIC为清水对照病情指数；DIT为处理病情指数。

1.3 消解动态试验

残留消解试验地点同田间药效试验。采用30%噁唑菌酮 · 精甲霜灵SC 按照有效成分300 mg/kg剂量于葡萄霜霉病初发期喷雾施药，共施药3 次，间隔期7 d。每小区6 株葡萄，每处理重复3 次。于第3 次施药后2 h 及1、3、5、7、10、14、21、28 d，分别按每株葡萄东、南、西、北、中方向随机采集1 kg 生长正常、无病害的葡萄果实样品2 份，混合均匀后四分法留样150 g。每处理留2 份样品，于 -20 ℃贮存。

1.4 分析方法

1.4.1 样品提取及净化 称取5 g 捣碎并匀浆后的葡萄样品于50 mL 离心管中，加入10 mL 乙腈，超声振荡15 min；加入1 g 氯化钠和4 g 无水硫酸镁，涡旋振荡5 min 后，于4 000 r/min 下离心3 min；取上层乙腈相1 mL 于依次装有20 mg PSA、5 mg GCB 和100 mg 无水硫酸镁的5 mL 离心管中，涡旋1 min，于10 000 r/min 下离心3 min，过0.22 μm滤膜，待检测。

1.4.2 检测条件 Agilent Poroshell 120EC-C18液相色谱柱 (50 mm × 3.0 mm，2.7 μm)，柱温30 ℃；流动相为V(乙腈) :V(0.1% 甲酸水溶液，含5 mmol 乙酸铵)=85 : 15，流速0.4 mL/min；进样量5 μL；干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化气压力210 kPa；毛细管电压4 000 V；多离子反应监测(MRM) 模式扫描。噁唑菌酮碎裂电压90 V，定量离子对 (m/z) 392/331，定性离子对(m/z) 392/238.1，碰撞能量11/7 eV，保留时间1.1 min；精甲霜灵碎裂电压110 V，定量离子对(m/z) 280.1/220，定性离子对 (m/z) 280.1/192，碰撞能量12/1 eV，保留时间0.9 min。

1.4.3 标准溶液配制及标准曲线绘制 称取噁唑菌酮标准品0.025 g (精准至0.000 1 g)，用乙腈溶解，配制成500 mg/L 的标准母液；称取精甲霜灵标准品0.125 g (精准至0.000 1 g)，用乙腈溶解，配制成2 500 mg/L 的标准母液。取噁唑菌酮标准母液0.5 mL 和精甲霜灵标准母液0.1 mL，用乙腈定容，得到5 mg/L 的噁唑菌酮-精甲霜灵混合标准母液，试验时再用乙腈逐级稀释得到10、1、0.5、0.1、0.05 和0.01 mg/L 的系列混合标准工作溶液。采用1.4.1 节方法提取得到的空白葡萄基质溶液稀释混合标准母液，配制得到10、1、0.5、0.1、0.05 和0.01 mg/L 的基质匹配混合标准溶液。按1.4.2 节方法进行检测，以进样质量浓度为横坐标、对应峰面积为纵坐标，分别绘制溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线。

1.5 添加回收试验

在葡萄空白样品中分别添加0.1、0.5、1 和5 mg/kg 4 个水平的噁唑菌酮和精甲霜灵混合标准工作溶液，每个水平重复5 次，测定回收率和相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与分析

2.1 联合毒力筛选结果

结果见表1。精甲霜灵与噁唑菌酮分别按质量比4 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2 及1 : 4 复配，对葡萄霜霉病菌的EC50值分别是精甲霜灵EC50值和噁唑菌酮EC50值的1.1～1.4 倍和1.4～1.8 倍，CTC 值均大于120，表现为增效作用；其中精甲霜灵与噁唑菌酮质量比为1 : 1 时混剂的增效作用最为明显，CTC 值为154.53。

表1 噁唑菌酮与精甲霜灵单剂及复配对葡萄霜霉病菌的毒力Table 1 Joint-toxicity and individual toxicity of famoxadone and metalaxyl-M to the toxicity of Plasmopara viticola

2.2 复配剂对葡萄霜霉病的田间防治效果

于第3 次药后7 d 及14 d 调查供试药剂对四川及北京田间葡萄霜霉病的防治效果。结果 (表2)表明：30% 噁唑菌酮 · 精甲霜灵悬浮剂120、150 和200 mg/kg 3 个有效成分剂量处理之间差异显著(P＜0.05)；有效成分剂量687.5 mg/kg 的68.75% 噁唑 ·锰锌水分散粒剂与150 mg/kg 的30% 噁唑菌酮 ·精甲霜灵悬浮剂防效相当；1 360 mg/kg 的68%精甲霜灵 · 锰锌水分散粒剂与120 mg/kg 的30% 噁唑菌酮 · 精甲霜灵悬浮剂防效相当。

表2 噁唑菌酮与精甲霜灵复配对葡萄霜霉病的田间防治效果Table 2 Field control efficacy of the mixture of famoxadone and metalaxyl-M for controlling grape downy mildew

2.3 残留分析方法有效性评价

结果表明：在0.01～10 mg/L 范围内，噁唑菌酮的基质匹配标准曲线线性方程为y=19 391x+1 729，相关系数r=0.999 5；精甲霜灵的基质匹配标准曲线线性方程为y=46 843x+ 87 314，相关系数r=0.999 4。噁唑菌酮及精甲霜灵进样质量浓度与对应峰面积之间均线性关系良好。噁唑菌酮在葡萄基质中的平均回收率为91%～107%，RSD 为1.5%～5.7%；精甲霜灵的平均回收率为92%～107%，RSD为2.1%～5.4%；均符合农药残留试验规范要求[13]。

2.4 残留消解动态

消解动态试验结果 (表3) 表明：噁唑菌酮在四川及北京试验点葡萄中的半衰期在8.9～12.8 d之间，精甲霜灵的半衰期在7.4～10.0 d 之间。噁唑菌酮及精甲霜灵在葡萄中的残留消解趋势稳定，均符合一级反应动力学方程。

表3 噁唑菌酮和精甲霜灵在葡萄中的残留消解动态Table 3 Dissipation dynamics of famoxadone and metalaxyl-M in grape samples

3 结论与讨论

将作用位点不同、作用机制互补的农药复配使用，能有效控制病害和延缓抗药性的发生、发展，在病害防治中发挥着越来越重要的作用[14]。噁唑菌酮能与多种杀菌剂混配使用，可有效缓解内吸性杀菌剂的抗性问题。精甲霜灵因其独特的手性结构，可增强杀菌剂与靶标位点的亲和性以及对病原菌细胞膜结构的影响。朱卫刚等[15]的研究表明，精甲霜灵与噁唑类杀菌剂复配增效作用明显，能有效扩大杀菌谱并降低单剂有效用量。

本研究室内毒力测定结果表明：精甲霜灵对葡萄霜霉病菌的EC50值为3.44 mg/L，表现出较高的抑制活性；噁唑菌酮对葡萄霜霉病菌的EC50值为4.47 mg/L。毕秋艳等[6]发现，同为 噁唑类杀菌剂的噁霜灵对葡萄霜霉病菌的EC50值为0.91 mg/L，表明噁唑类杀菌剂对葡萄霜霉病菌的抑制效果良好。已有研究表明，复配农药的室内毒力测定结果除了受药剂本身特性影响之外，还与作物品种、作物抗性水平等因素有关[16]。本研究中将噁唑菌酮与精甲霜灵复配，对葡萄霜霉病菌的CTC 值在123.81～154.53 之间，供试葡萄品种 ‘红提’ 为感病品种[16]，这可能是本研究中CTC 值偏低的原因之一。

采用与室内毒力筛选所得最佳配比 (噁唑菌酮与精甲霜灵质量比1 : 1) 相同的30% 噁唑菌酮 ·精甲霜灵悬浮剂，按有效成分200 mg/kg 的剂量进行田间葡萄霜霉病防治试验，第3 次药后14 d防效可达83.9%，与寇爽等[17]报道的68.75% 噁酮 · 锰锌水分散粒剂有效成分用量859 mg/kg 的防效 (85.7%) 相当，但本研究的有效成分用量明显降低，可见噁唑菌酮与精甲霜灵复配剂的效果优于噁唑菌酮与代森锰锌复配剂。

农药性质、作物品种、试验点气候条件等因素均会影响农药在作物上的消解[18]。杨庆喜等[18]的研究表明，中国地域平均日照时长差异会对农药的降解产生影响，本研究中北京与四川地区日照差异可能是导致两个试验点噁唑菌酮和精甲霜灵半衰期差异的原因之一。刘茜等[19]及颜丽菊等[20]研究指出，相同作物不同品种的半衰期存在差异，本研究中北京和四川田间试验的葡萄品种分别为 ‘黑宝石’ 和 ‘巨峰’，品种差异可能对半衰期有一定的影响。本研究中噁唑菌酮和精甲霜灵在葡萄中的半衰期分别为8.9～12.8 d 和7.4～10.0 d，均属于易降解性农药[21]。

农药复配依然是目前有效防治病害和治理抗药性的重要手段，而对已登记农药的合理复配是主要途径之一。本研究表明，将噁唑菌酮与精甲霜灵复配，在降低各单剂有效成分用量的同时对葡萄霜霉病防效好、残留低、易降解且使用安全，符合国家农药减量增效政策导向，具有一定的应用前景。