山药根结线虫病发生动态及根层施药防治技术研究

李信申, 曾 荣, 方文生, 陈 建, 曹坳程*,, 华菊玲*,

(1. 江西省农业科学院 植物保护研究所，南昌 330200；2. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193)

山药为薯蓣属(Dioscorea)一年生或者多年生缠绕性草质藤本植物，富含糖类、蛋白质和矿物质等成分，还含有丰富的皂苷、黏液质、黄酮等生理活性成分，是滋补保健佳品[1]。山药种植已成为农民增收和产业致富的重要渠道。

根结线虫(Meloidogynespp.)为全球前三大植物寄生线虫之一，寄主范围非常广泛，几乎能侵染所有的维管束植物[2]。常见的根结线虫包括南方根结线虫Meloidogyneincognita、花生根结线虫M.arenaria、爪哇根结线虫M.javanica、北方根结线虫M.hapla和象耳豆根结线虫M.enterolobil。由根结线虫引起的山药根结线虫病一直是全球山药生产上的顽疾[3-4]。不仅在山药根系和块茎上形成根结和虫瘿，还可引发山药块茎不规则根增殖、植株生长发育迟缓与黄化，显著降低山药的品质与产量[5]。在山药产量占全球产量90%的西非地区[6]，每年因山药根结线虫造成的损失高达30%以上[7]。近年来，随着我国山药栽培面积的扩大，山药根结线虫病的发生日趋严重。苏莱曼[8]对江西、山东山药线虫发生与分布情况调查显示，根际土壤和块茎中根结线虫检出率均达65%。据本项目组调查，2018—2020 年，江西瑞昌、万载、永丰、泰和、南城、安远、于都、兴国及龙南等山药主产县(市) 根结线虫病普遍发生，大多数田块发病率在30%以上，严重田块发病率高达100%。产量损失巨大，生产中因病弃收的现象屡见不鲜。根结线虫病已成为制约山药产业发展的瓶颈。

山药适种区域十分有限，根结线虫寄主广泛，轮作防治实施困难。不同种类山药对根结线虫的抗性水平存在差异[9]，全球广泛种植的圆山药D.rotundata和长山药D.opposita，由于具有较高的淀粉含量和较低的酚含量，导致其对根结线虫的抗性普遍低于参薯D.alata、甘薯D.esculenta和黄山药D.cayenensis等[9-11]，并且同一个山药品种的抗性水平因地理区域、土壤质地等因素也存在较大差异[12]。Claudius-Cole 等[10]报道，山药与合萌Aeschynomene histrix、柽麻Crotolaria juncea、万寿菊Tagetes erecta等作物间作能有效控制根结线虫对山药的为害，但受生产成本、田间管理不便等因素限制，在山药生产中实际应用少。因此，药剂防治仍然是山药根结线虫病有效可行的防治方法之一。

播种或移栽前撒施药剂进行土壤处理是作物根结线虫药剂防治简便、常用的方法[13]。山药生育期较长，在江西种植区域，出于用工成本考虑，山药种植时间大多集中在春节前后，而出苗期多在4 月中下旬，因而种植前进行土壤处理并不能有效发挥药剂的防治效果。因此，因地制宜地掌握土壤中根结线虫2 龄幼虫 (J2) 数量消长动态及山药线虫病的发生动态是制定药剂防治适期的关键，国内外尚未见系统的研究报道。山药块茎深扎地下，根结线虫在土壤中的分布可达50 cm以下[14]，灌根、微喷、滴灌等常规施药技术效果不理想，且药剂流失严重，尤以南方黏重土壤为甚。因此，生产上急需一套高效可行的科学施药方案。为此，本研究以荣获国家地理标志农产品的 ‘瑞山药’ 为研究对象，在鉴定山药根结线虫种类、定期调查探明土壤根结线虫J2 数量消长动态和山药根结线虫病田间发生动态，以及在研发根层均匀施药器的基础上，开展不同施药时期和施药方法对山药根结线虫病防治效果的分析，以期研发出精准高效的药剂防治技术，实现药剂防治技术效益最大化，契合产业绿色发展的需求。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试品种：‘瑞山药D. polystachyaTurczaninow cv. Tiegun’(瑞昌市农业农村局山药种质保存中心提供)。

供试药剂及仪器：5%阿维菌素乳油(abamectin 5% EC，河北三农农用化工有限公司)；30%噻唑膦微囊悬浮剂(fosthiazate 30% SC，河北三农农用化工有限公司)；41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂(fluopyram 41.7% SC，拜耳股份公司)；100 亿芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂(Bacillus firmus，WP，江西顺泉生物科技有限公司)。倒置显微镜IX53(日本奥林巴斯公司)；体视镜M80 (德国徕卡仪器有限公司)。

供试虫源：南方根结线虫 (M. incognita,JXMI01) 、花生根结线虫 (M.arenaria, JXMA01)、爪哇根结线虫 (M.javanica, JXMJ01) 和北方根结线虫 (M.hapla, JXMH01)，均保存于江西省农业科学院植物保护研究所水稻及特色作物病害防治实验室内。

山药根结线虫病标本采自江西省瑞昌市山药核心种植区域试验田 (范镇范镇村，29°59′N，115°58′E；高丰镇乐丰村，29°64′N，115°56′E) 和江西省南昌县蔬菜种植基地试验田 (南昌县小兰乡涂家村，28°38′N，115°97′E)。

1.2 试验方法

1.2.1 病原鉴定 从3 个地点的9 块试验田分别采集山药根结线虫病样本，每块田采集5 个以上。表面清洗后，在体视镜下挑取根系上的卵囊，25 ℃培养孵化出J2 后，使用4 种根结线虫(M.incognita、M.arenaria、M.javanica和M.hapla)的特异性引物进行 PCR 鉴定，引物序列及PCR 方法参考孟庆鹏等[15]方法。同时将J2 配制成悬浮液，接种于山药苗 (感病品种 ‘瑞山药’，用零余子在灭菌基质中栽培繁种的种苗) 根部。60 d 后观察线虫的致病性。

1.2.2 土壤根结线虫J2 数量消长动态监测 2019年分别在瑞昌市范镇范镇村和南昌县小兰乡涂家村建立山药土壤根结线虫监测圃。试验田块为2 年连作地，面积约667 m2，平均划分为3 个小区。开沟条播，栽培密度约60 000 株/hm2，试验田四周设保护行。播种日期为1 月13 日 (范镇村)、1 月18 日 (涂家村)。取样时间分别为1 月下旬、4 月中旬、6 月下旬、8 月下旬和10 月下旬。每小区对角线5 点取样，每点3 株，在距山药块茎或藤基部5～10 cm 处钻取0～80 cm 深的土样，于每株的4 个方位各取1 份子样，再将4 个子样混合均匀作为1 个样品。每个样品取100 g，采用浅盘浸泡技术[16]从土壤样本中分离线虫。于倒置显微镜下对根结线虫J2 进行计数。每个样品重复3 次。

1.2.3 病害田间发生动态调查 2019—2020 年分别在瑞昌市范镇范镇村和南昌县小兰乡涂家村建立山药根结线虫病观察圃。试验田块为2～3 年的连作地，面积约667 m2，平均划分为3 个小区。开沟条播，栽培密度约60 000 株/hm2，试验田四周设保护行。2019 年播种日期为1 月13 日 (范镇村) 、1 月18 日 (涂家村)，2020 年播种日期为1 月5 日 (范镇村) 、1 月3 日 (涂家村)。当山药出苗率达50%以上后，每小区对角线5 点取样，每点挖取3 株。吸收根病情调查时间为5 月中旬至6 月上旬，块茎病情调查时间为5 月底至收获前。5 月份每隔5 d左右调查1 次，6 月份每隔10 d 左右调查1 次，7 月份以后，每隔30 d 左右调查1 次。吸收根病情分级标准划分为[17]：0 级，根系无根结；1 级，有根结的根系比例低于10.0%；3 级，有根结的根系比例为10.1%～25.0%；5 级，有根结的根系比例为25.1%～50.0%；7 级，有根结的根系比例为50.1%～75.0%；9 级，有根结的根系比例为75.1%以上。块茎病情分级标准划分为[17]：1 级，块茎有少量虫瘿 (虫瘿面积占块茎面积10.0% 以下)；3 级，虫瘿面积占块茎面积的10.1%～25.0%；5 级，虫瘿面积与块茎面积比为25.1%～50.0%；7 级，虫瘿面积与块茎面积比为50.1%～75.0%；9 级，虫瘿面积与块茎面积比大于75.1%。整个试验期间不喷施任何杀线虫药剂，其余按大田常规管理。根据公式 (1) 计算病情指数(DI)。

其中：DI为病情指数，Ni为各级病株数，i为相应的级数值，Nt为调查总株数。

1.2.4 药剂防治适期研究 药剂防治适期试验2019 年在瑞昌市范镇范镇村进行，2020 年分别在瑞昌市高丰镇乐丰村和南昌县小兰乡涂家村进行。试验田块均为连作地块。2019 年播种日期为1 月12 日 (范镇村)，2020 年播种日期为1 月6 日(乐丰村) 、1 月4 日 (涂家村)。播种前，种薯用5%阿维菌素EC (有效成分50 mg/kg) 浸种。开沟条播，栽培密度约60 000 株/hm2，试验田四周设保护行。试验共设8 个处理，施药时间、供试药剂及用量见表1。每处理重复3 次，共24 个小区，随机区组排列。2019 年范镇村小区面积26.6 m2，总株数152 株/小区 (出苗率95%，下同)；2020 年乐丰村小区面积31.0 m2，总株数177 株/小区；2020 年涂家村小区面积38.5 m2，总株数219 株/小区。施药方法采用作物根层均匀施药器 (枪尖长度60 cm，施药孔共6 排，每排4 个孔)[18](简称根层均匀施药技术，Ea) 进行定量施药，药液流速100 mL/s，药液量1 000 mL/株，施药枪入土深度60 cm。于收获期 (11 月底) 调查各处理薯块病情。调查方法为全小区调查，记录各级病薯数，同时进行产量测定。病薯分级标准及病情指数计算方法同1.2.2 节，按 (2) 式计算防治效果。

表1 2019 和2020 年施药时间及用药剂量Table 1 Dosages and spraying times of nematicide between 2019 and 2020

式中：P为防治效果，DICK为空白对照病情指数，DIPT为处理病情指数。

1.2.5 施药方法试验 2020 年分别在瑞昌市高丰镇乐丰村和南昌县小兰乡涂家村进行。播种日期为1 月6 日 (乐丰村) 、1 月4 日 (涂家村)。播种前，种薯用5%阿维菌素EC (有效成分50 mg/kg)浸种。开沟条播，栽培密度约60 000 株/ hm2，试验田四周设保护行。试验共设5 个处理：处理Ⅰ，2 次施药方法均为根层均匀施药 (Ea)；处理Ⅱ，第1 次施药方法为滴灌 (Di)，第2 次施药方法为根层均匀施药 (Ea)；处理III，2 次施药方法均为滴灌 (Di)；处理IV，2 次施药方法均为常规灌根 (Wr)；CK，空白对照。第1 次、第2 次施药时间分别为山药齐苗时 (5 月下旬) 及其后60 d 左右 (7 月下旬)。第1 次选用速效杀线虫剂与持效生物菌剂组合，30%噻唑膦微囊悬浮剂 (有效成分2 925 g/hm2) + 100 亿芽孢/克坚强芽孢杆菌可湿性粉剂 (有效成分12 000 g/hm2)；第2 次选用毒性更低的药剂，41.7% 氟吡菌酰胺悬浮剂 (有效成分1 426 g/hm2)。每处理重复3 次，共15 个小区，随机区组排列。乐丰村小区面积51.2 m2，总株数292 株/小区；涂家村小区面积43.8 m2，总株数250 株/小区。所有处理每株施药液量均为1 000 mL，根层均匀施药方法同1.2.3 节，滴灌和灌根按常规进行。收获期 (11 月下旬) 调查各处理薯块病情。病情调查、防治效果计算同1.2.3 节。

1.3 数据分析

采用DPS 2.00 软件对数据进行统计分析，应用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 根结线虫种类鉴定

从3 个地点的9 块试验田采集样本，共挑取45 个根结线虫J2 样本进行分子生物学鉴定，这些线虫均扩增出了与阳性对照南方根结线虫M.incognitaJXMI01 一致的约955 bp 的特异性DNA条带 (图1A)。致病性鉴定结果表明：根结线虫J2 回接山药后，山药根系出现典型的根结症状(图1B)。综合结果表明，3 个地点9 块试验田的根结线虫均为南方根结线虫M.incognita。

图1 山药根结线虫种类鉴定及致病性测定Fig. 1 Specie identification and pathogenicity determination of root-knot nematodes in yam

2.2 土壤南方根结线虫J2 数量消长动态

监测结果 (表2) 表明，4 月中旬土壤中J2 数量为1 月中旬的4 倍以上，6 月中旬J2 数量有所下降，但之后J2 数量持续上升。至10 月中旬，土壤中J2 数量为1 月下旬的7 倍以上。

表2 土壤根结线虫2 龄幼虫 (J2) 数量消长动态 (2019)Table 2 Population dynamics of the 2nd instar larvae (J2) of yam root-knot nematode in the soils (2019)

2.3 山药根结线虫病田间发生动态

调查结果见图2。5 月中旬至6 月中旬山药吸收根病情系统调查显示，吸收根根结线虫病于5 月下旬 (齐苗前后) 开始发病。5 月底至收获前(11 月底)，山药块茎病情系统调查显示，块茎根结线虫病于6 月中下旬开始发病，此后病情持续增长，至收获期病情指数高达37.04～65.19。

图2 山药根结线虫病病情指数增长动态 (2019—2020，南昌和瑞昌)Fig. 2 Growth dynamics of disease indexes of yam root-knot nematode disease (2019-2020, Nanchang and Ruichang)

2.4 施药时期对山药根结线虫病的防治效果

2019 年瑞昌市范镇范镇村、2020 年南昌县小兰乡涂家村和瑞昌市高丰镇乐丰村等地试验结果(表3) 表明，供试药剂41.7%氟吡菌酰胺悬浮剂(有效成分1 426 g/hm2)、30%噻唑膦微囊悬浮剂(有效成分2 925 g/hm2)均以在山药齐苗时 (5 月下旬) 及其后60 d 左右 (7 月下旬) 各施药1 次处理对根结线虫病的防治效果最好，分别达81.56%～83.43%、75.95%～77.16%；山药开始萌动前 (4 月下旬) 及其后60 d 左右 (6 月下旬) 各施药1 次处理的防治效果次之，分别为70.16%～71.17% 和55.49%～59.15%；齐苗后30 d 左右 (6 月下旬) 、90 d 左右 (8 月下旬) 各施药1 次处理的防治效果分别为52.95%～55.95%和46.03%～51.83%；而仅于山药齐苗时 (5 月下旬) 施药1 次处理的防治效果则低于45%。差异显著性分析显示，山药齐苗时及其后60 d 左右各施药1 次处理的防治效果显著高于其余处理，山药萌动前及其后60 d 左右各施药1 次的防治效果显著高于齐苗后30、90 d 左右各施药1 次处理，山药齐苗时施药1 次处理的防治效果则显著低于上述处理。

表3 不同施药时间对山药根结线虫病的防治效果Table 3 The control efficacy of different spraying times of nematicides on yam root-knot nematode disease

2.5 施药方法对山药根结线虫病的防治效果

对比分析不同施药方法组合对山药线虫病的防治效果 (表4) 显示：2 次均采用根层均匀施药处理的防治效果最好 (80%以上)，显著高于其余处理；第1 次滴灌、第2 次根层均匀施药处理的防治效果次之 (75%以上)，2 次均采用滴灌的处理防治效果相对较差，低于70%；而2 次均采用灌根的处理防治效果显著降低，仅为50%左右。

表4 不同施药方法组合对山药根结线虫病的防治效果Table 4 The control efficacy of different spraying methods of nematicides on yam root-knot nematode disease

3 讨论与结论

经鉴定，江西瑞昌市范镇范镇村、高丰镇乐丰村和南昌县小兰乡涂家村试验田的山药根结线虫均为南方根结线虫，这一研究结果与苏莱曼[8]报道的江西、山东山药根结线虫病病原一致。

春季温度回升后，土壤中越冬存活卵孵化出大量的J2 线虫[19]，因而4 月中旬土壤中J2 数量大幅上升。山药出苗后，大量J2 侵入山药根系和块茎，导致6 月土壤中J2 数量下降。之后，不断生长的块茎为线虫繁殖提供了丰富的营养物质，因而土壤中的J2 数量不断增长。‘瑞山药’ 吸收根一般于5 月上旬左右开始萌动，根系萌动产生的二氧化碳等会诱集J2 定殖、侵染，5 月下旬 (山药齐苗) 根系开始发病。块茎发病时间晚于根系，于6 月中下旬开始发病。此后，随着块茎的不断生长膨大，其丰富的营养为线虫提供了优质的繁衍场所，导致病情指数大幅并且持续上升。本研究首次系统地监测了土壤中南方根结线虫J2 数量消长动态及山药根结线虫病的发生动态，为该病害的有效防控提供了依据。

研究发现，施药1 次对山药根结线虫病的防治效果显著低于施药2 次的。这是因为山药生育期长达200 d 以上，根结线虫病发病持续时间长，1 次施药不足以将根结线虫数量持续控制在较低水平。在施药2 次的3 种处理中，以山药齐苗及其后60 d 左右各施1 次的防治效果最好。山药齐苗时，根结线虫处发病初期，此时施药，能显著降低土壤中根结线虫数量，同时通过根系的吸收传导，可有效杀灭山药体内线虫，60 d 后再次施药，使山药根系土壤中线虫数量维持在较低水平，从而有效防控山药根结线虫病的发生。山药萌动前及其后60 d 左右各施药1 次的防治效果低于山药齐苗及其后60 d 左右各施1 次处理，是因为第2 次施药离山药收获间隔时间长，土壤中线虫数量仍在持续增长，但药剂的持效期有限，噻唑膦防治效果降低尤为显著，这一研究结果与迟元凯等[20]栝楼根结线虫药剂防治研究结果一致。而第1 次施药时间太晚，未能及时有效防控初始病情，是齐苗后30、90 d 各施药1 次防治效果不理想的重要原因。本文基于土壤南方根结线虫J2数量消长动态及山药线虫病发生动态，首次提出了山药南方根结线虫病药剂防治适期，对该病害高效、精准防控具有十分重要的指导意义。后续将跟踪分析不同防治时期施药对山药根围土壤根结线虫数量消长的影响，从而为药剂防治适期的制定提供进一步的依据。

随着作物的生长和根系的发育，植物寄生性线虫在作物根围土壤中的分布呈现时空增长动态。尽管大量研究表明，作物根围土壤根结线虫主要集中分布在0～30 cm 土层[21]，但作物根系特征如深浅、资源利用能力等对土壤线虫的垂直分布有较大的影响[22-24]。山药种植前多用挖机深翻，上下层土壤交混程度较常规翻耕高；山药根系和块茎深扎地下，引导着线虫的分布随着山药块茎的生长不断下移[25]。董文芳[26]的研究表明，在山药根围40～80 cm 土层中，每100 g 土样线虫数量高达数百条。常规灌根施药，药液在土壤中向下渗透深度及药量十分有限，并且流失大，因而防治效果差。常规滴灌施药，药液向下渗透深度也有限，对于山药生长后期根结线虫病的防控不利，导致防治效果不理想。本研究研发的山药根层均匀施药技术，施药深度可达60 cm，加上药液的向下渗透作用，使得药液可分布至山药块茎到达整个土层，能实现对整个块茎的保护和治疗作用，因而能发挥良好的防治效果。第1 次施药采用滴灌技术，第2 次施药采用根层均匀施药技术，对山药根结线虫病也具有较好的防治效果。后期将跟踪监测根层均匀施药技术对山药根围不同土层根结线虫数量动态的影响，为该技术的大面积推广应用提供理论依据。

综上所述，本研究探明了山药南方根结线虫病发生动态，首次提出了“以山药齐苗时及其后60 d 左右各施药1 次”的药剂防治适期，研发出的山药根层均匀施药技术对山药根结线虫病具有优良的防治效果。下一步将开展山药根围土壤根结线虫数量动态系统监测及根层均匀施药技术对山药根围不同土层根结线虫数量影响分析，以期为山药根结线虫病的高效防控提供理论和技术支撑。