胆、肠菌群差异性与胆囊胆固醇结石形成关系

杜国涛，王青，赵伟伟，张兆波，孙悦，赵鹏程，刘建中

（沧州市人民医院 胃肠外科，河北 沧州 061000）

据最新统计，目前发达国家和地区胆结石患病率达20%；我国胆结石患病率为10%，胆囊胆固醇结石患者占比超80%，并呈逐年增加趋势[1]。随着我国居民饮食习惯的改变，以胆汁胆固醇过饱和造成的胆囊胆固醇结石病例为主要亚型，其次为胆囊运动功能异常亚型。胆囊运动障碍、胆固醇代谢紊乱、胆固醇反向转运、代谢紊乱综合征可导致胆固醇超饱和，引起胆固醇、胆汁酸盐及磷脂三者比例失衡，进而形成胆结石[2]。胆囊胆固醇结石是一种多发的常见病，结石的形成过程极其复杂，目前关于其形成原因学界尚存争议，蒋婷等[3]认为胆固醇结石的形成机制主要包括胆汁中胆固醇超饱和、成核因子致微泡稳态失衡和胆汁纤溶系统紊乱；Swidsinski等[4]认为细菌源性物质可通过影响人体免疫代谢产物，进而促使胆囊胆固醇结石的形成；王强等[5]认为肠道微生态失衡可影响胆汁酸的肝肠循环，导致胆汁酸和胆固醇代谢紊乱，在胆固醇结石的发生过程中发挥重要作用；蒋兆彦等[6]认为胆固醇结石形成的首要条件是胆汁胆固醇过饱和。胆道菌群与人体免疫代谢协同作用可致使胆囊胆固醇结石的形成；同时，肠道菌群代谢与人体免疫代谢密切相关。故本文基于胆囊胆固醇结石患者胆道菌群、肠道菌群差异性，探讨胆、肠菌群交互与胆囊胆固醇结石形成关系，为其他结石类基本的形成原因提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2020年1 月至2020年6 月由沧州市人民医院诊疗的胆囊胆固醇结石患者42例为研究对象，记入胆固醇结石组；同时，选取同时期于本院接受胆囊炎、胆囊息肉诊治等非胆固醇结石患者40例为非胆固醇结石组。两组患者年龄40～65岁，胆固醇结石组平均年龄（47.8±10.2）岁，非胆固醇组平均年龄（45.3±4.9）岁。非胆固醇结石组男、女各20例；胆固醇结石组中男18例，女24例。两组患者的性别、年龄、体重、病程等一般资料比较均无统计学意义（P＞0.05）。本研究已获批沧州市人民医院伦理委员会批准，所有的患者均签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器

QIAamp DNA Stool Mini Kits化学裂解试剂盒（QIAGEN公司，德国）；MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN公司，德国）；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM试剂盒（上海酶联科技生物有限公司，中国）。DYY-61型电泳仪（北京六一仪器厂，中国）；Illumina HiSeq测序平台（Illumina公司，美国）；MJ PCT220 PCR（MJ公司，美国）。

1.3 样品收集

非胆固醇结石组和胆固醇结石组患者均采用术中胆囊穿刺法收集胆汁1.5～2.0 mL；胆固醇结石组在不碎石的情况下，术中收集直径为0.8～1.0 cm的结石，且以无菌生理盐水冲洗；同时，收集胆固醇结石患者和非胆固醇结石患者手术前一天或当天晨起粪便约10 g；所有样本于收集后，迅速经液氮淬灭后置于-80 ℃冰箱内保存。

1.4 DNA提取与建库测序

非胆囊胆固醇结石患者和胆囊胆固醇结石患者胆汁、结石及粪便DNA 提取采用物理破碎及QIAamp DNA Stool Mini Kits化学裂解试剂盒相结合进行。建库测序：提取样品总DNA后，参照相关文献设计得到引物，在引物末端加上测序接头，进行16S rRNA基因VI-V2可变区域的PCR扩增，并采用琼脂糖凝胶电泳及MinElute Gel Extraction Kit进行对PCR产物进行纯化、采用Quant-iTPicGreen dsDNA Kit进行定量分析和均一化形成测序文库，经质检合格的文库样本用Illumina HiSeq 2500进行测序，并进行细菌OTU鉴定。

1.5 胆囊胆固醇结石的定量分析

精密称重所有结石样本，经氯仿/甲醇（2:1）萃取后，采用CHOD-PAP法及NanoDrop 2000 分光光度计对结石样本定量分析胆固醇含量。

1.6 细菌DNA检出率及细菌菌落数比较

利用qPCR方法检测两组患者胆汁样本中DNA阳性率及菌落数。

1.7 胆汁免疫球蛋白检测

采用放射免疫检测试剂盒免疫计数仪检测胆汁免疫球蛋白IgA、IgG和IgM表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 两组细菌DNA检出率及细菌菌落数的比较

非胆固醇结石组患者胆汁细菌DNA 阳性率47.50%（19/40）低于胆固醇结石组69.04%（29/42）（χ2=3.919，P＜0.05）；同时胆汁细菌菌落数（3.29±1.21）低于胆固醇结石组（5.74±1.08）（P＜0.001）。

2.2 两组胆汁免疫球蛋白检测比较分析

胆固醇结石组患者胆汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量显著高于非胆固醇结石组，IgG含量略高于非胆固醇结石组，但差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 胆汁免疫球蛋白检测比较

2.3 胆囊胆固醇结石的定量分析

依据Marschall、Swidsinski和Portincasa学者对胆固醇结石中胆固醇含量的定义，在所有结石样本中，胆固醇含量在≤70%、70%～89%及≥90%分别为3、38及1例。

2.4 两组菌群分析

测序数据质量评估：根据胆汁及粪便样本各阶段的序列长度（AvgLen（bp）），G和C类型的碱基占总碱基的百分比（GC），质量值≥20 或30 的碱基占总碱基数的百分比（Q20 和Q30），有效的优化序列的百分比（Effective）等参数对所有样本数据进行评估，见表2。结果表明所有测序样本Q20和Q30大于90%，优化序列的百分比均大于80%，符合质量评估要求[7]。

表2 样品测序数据处理分析

对优化序列在97%的相似度水平下进行聚类、获得OTU数目，可知粪便样本胆固醇结石组OTU数目显著小于非胆固醇结石组（P＜0.001）。并分别从界（Kindom）、门（Phylum）、纲（Class）、目（Order）、科（Family）、属（Genus）、种（Species）展示各等级物种数目统计，可知胆汁样本胆固醇结石组种数目显著大于非胆固醇结石组（P＜0.001），见表3。

表3 样品各等级物种统计表

对样品Alpha多样性指数进行评估，如表4 所示。Chao1和Ace指数衡量物种丰度即物种数量的多少，可得出粪便样本胆固醇结石组Chao1和Ace指数显著低于非胆固醇结石组，即胆固醇结石患者胆汁菌群物种数量显著小于非胆固醇结石组（P＜0.001）。Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性，据Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高，可知胆固醇结石患者粪便菌群物种多样性小于非胆固醇结石组。此外，由稀释性曲线及Shannon指数曲线均表明胆固醇结石患者粪便样本多样性少于非胆固醇结石组，见图1。

图1 两组稀释性曲线（A、B）及Shannon指数曲线（C、D）

表4 Alpha多样性指数分析

鉴于细菌门类型的保守性，其作为最高的分类单元，可异质性反映人体特定部位细菌群落结构，故在本实验中先期对细菌在门水平上进行解析。从中可知，厚壁菌门（Firmicutes）和梭杆菌门（Fusobacteria）为胆汁中的优势细菌类群，厚壁菌门、放线菌门（Actinobacteria）及拟杆菌门（Bacteroidetes）为粪便样本中的优势细菌类群。其次，人体特定部位微环境常常由细菌种属水平来反映，在本实验中，胆固醇结石组胆汁及粪便样本中Roseburia相对丰度均显著低于非胆固醇结石组；且非胆固醇结石组粪便样本中Sporococcus相对丰度显著高于胆固醇结石组。见图2。

图2 两组菌群分析

3 讨论

随着人民生活水平的稳步提高，膳食结构以及生活方式发生了很大变化，如过量摄入高脂肪、高糖类、高胆固醇食物，早餐不规律，缺乏运动等不健康生活习惯均是形成胆结石的重要因素。胆结石又称胆石症，是指胆道系统包括胆囊或胆管内发生结石的疾病；包括胆囊结石、胆总管结石、肝胆管结石[8]。胆囊结石的患者数量越来越多，我国发病率高达10%，且集中在＞40岁的人群，主要为胆固醇结石；其发生不仅与年龄，饮食，行为习惯相关，且受肥胖、高脂血症、2型糖尿病、肝硬化等相关疾病因素的影响；另外，妊娠作为胆囊结石常见病因之一，使得女性发病率远高于男性[9]。胆固醇结石的形成与个体中含造石基因的遗传因素、肝胆固醇的过度分泌、胆汁的过饱和及快速相变、胆囊的运动减弱、肠道菌群等因素有关[10]。胆囊胆固醇结石是一种消化系统常见疾病，发病率逐渐升高，若不及时治疗，极有可能引起继发感染，导致胆囊癌及胆道系统恶性肿瘤的发生，危害患者生命安全。胆囊胆固醇结石的形成原因较复杂，发生机制尚未完全阐明。目前已有研究表明，胆色素结石、混合性结石、胆固醇结石中均存在细菌，而细菌可以促进胆固醇过饱和、产生促成核因子、促进免疫球蛋白和黏液蛋白分泌，从而参与结石的形成[5]。由此推测，胆道细菌感染与胆囊结石的形成有着密切关系。

正常生理状态下，肠道菌群参与人体内物质与能量代谢，促进免疫系统发育与成熟，可形成屏障隔断病原体对宿主的攻击，从而维持人体内稳态[11-12]。然而，一旦肠道微生态失衡，就可能引起肠炎、结肠癌和胆囊结石等慢性疾病的发生与发展[5，13]。因此，肠道菌群失衡是胆固醇结石发生的关键因素。因此，本文基于胆囊胆固醇结石患者胆道菌群、肠道菌群差异性，对胆、肠菌群交互与胆囊胆固醇结石形成关系进行了探讨。结果显示，非胆固醇结石组患者胆汁细菌DNA阳性率47.50%（19/40）低于胆固醇结石组患者胆汁细菌DNA阳性率69.04%（29/42）（P＜0.05）；细菌菌落数亦低于胆固醇结石组（P＜0.05）。胆汁免疫球蛋白检测结果表明，胆固醇结石组患者胆汁中IgA含量显著高于非胆固醇结石组（P＜0.05）。菌群分析结果显示，厚壁菌门（Firmicutes）和梭杆菌门（Fusobacteria）为胆汁中的优势细菌类群，厚壁菌门、放线菌门（Actinobacteria）及拟杆菌门（Bacteroidetes）为粪便样本中的优势细菌类群。

目前，有关胆道菌落结构与胆囊结石关系的研究报道较少。一个世纪前有学者在胆结石患者的胆汁中培养出了多种细菌，推测结石的形成与胆道细菌感染离不开[14]。研究表明，虽胆囊胆固醇结石患者与正常人在菌群结构上无明显差异，但与正常人相比，患者的免疫球蛋白水平明显升高，这提示结石的形成可能与免疫球蛋白水平有关[15-17]。免疫球蛋白IgA、IgG可提升胆固醇成核活性，影响胆囊胆固醇结石患者的胆道内菌群，进而促进胆结石的形成[15]。方驰华等[18]率先证实胆囊结石中存在细菌，并认为细菌是形成结石的重要因素。Lee等[19]研究表明肠源细菌在结石形成过程中发挥重要作用；陶应田等[20]认为胆汁中游离胆红素增多，引起细菌感染，导致结石形成。本实验对胆汁免疫球蛋白进行了检测，发现胆固醇结石组患者胆汁中IgA（P＜0.001）和IgM（P＜0.05）含量显著高于非胆固醇结石组，由此可推断胆囊胆固醇结石的形成与胆汁免疫球蛋白水平有关。实验结果显示非胆固醇结石组患者细菌菌落数（3.29±1.21）显著低于胆固醇结石组患者细菌菌落数（5.74±1.08）（P＜0.001），推测胆囊胆固醇结石患者胆道内菌群与结石的形成存在一定的关系。

肠道微生物参与调控人体免疫系统、物质的能量代谢、涉及氨基酸、维生素等必需营养物质的生物合成，在维持机体稳态中发挥重要作用。肠道菌群随着外界环境、饮食结构、年龄等因素的改变而波动，但整体维持在一定范围。代谢性疾病的发生往往伴随着肠道微生态失衡；而胆囊结石是一种常见的消化系统疾病，胆汁酸代谢紊乱是其形成的重要因素，且胆汁酸的代谢受肠道菌群的调节[21]。因此，从肠道菌群与胆汁酸的关系的角度探讨胆囊结石的成因，是很有必要的。Wu等[13]以胆囊结石患者及正常人的胆汁及粪便为研究对象，首次采用16S rRNA扩增子测序技术对其进行研究，结果显示胆囊结石患者存在明显的肠道菌群失调。刘超等[2]认为胆固醇结石的发生与胆汁中胆固醇浓度、促/抑成核因子的动力学稳态有关。Keren等[22]发现胆囊切除后，胆汁的流向发生了改变，引起胆汁酸与肠道微生物之间的关系发生改变，进而认为结石患者治疗后复发率高可能与肠道菌群的改变有关。邓太平等[23]研究发现，胆石症患者存在胃肠道健康风险，且其体内肠道菌群明显失调。Wang等[24]发现胆固醇结石小鼠肠道中厚壁菌门及其与拟杆菌比值均降低；研究表明无菌小鼠肠道接种细菌后，胆汁酸合成减少，从而促进胆固醇结石发生，提示胆汁酸的合成与肠道菌群有关[25-26]。

通过实验我们发现，胆固醇结石患者胆汁菌群物种数量显著小于非胆固醇结石组，粪便菌群物种多样性小于非胆固醇结石组；厚壁菌门和梭杆菌门为胆汁中的优势细菌类群，厚壁菌门、放线菌门及拟杆菌门为粪便样本中的优势细菌类群；胆固醇结石组胆汁及粪便样本中Roseburia相对丰度均显著低于非胆固醇结石组；且非胆固醇结石组粪便样本中Sporococcus相对丰度显著高于胆固醇结石组。由此可知：胆囊胆固醇结石患者和非胆固醇结石患者的胆道、肠道细菌种类相似，相对丰度存在差异，且胆道和肠道中存在共有的细菌，但由于胆囊胆固醇结石相关细菌具有复杂性，故胆囊胆固醇结石的具体发生机制有待进一步深入研究。