高龄女性新鲜周期不同发育天数胚胎移植的临床分析

王龙梅，邱乒乒，纪红，姜雨飞，李萍

厦门大学附属妇女儿童医院生殖医学科（厦门市生殖与遗传重点实验室），福建厦门 361003

随着社会的发展，越来越多的女性推迟生育。研究表明女性生育力在32 岁时下降，在37 岁后下降的速度增加[1]。在先进且日趋成熟的辅助生殖技术帮助下，高龄不孕患者有能力实现怀孕。然而，高龄是女性不孕症和产科并发症的危险因素[2-3]，患者在进行不孕症治疗前应充分了解和评估潜在的并发症。女性年龄的增长伴随着卵母细胞数量的减少及染色体异常的风险增加[4-6]。大量研究表明，囊胚经过了体外初步淘汰过程，移植后妊娠率较卵裂期胚胎显著提高。不过囊胚在培养箱内培养的时间较长，而较短时间的体外培养有利于降低外界环境对胚胎的影响，此外高龄女性获卵数减少，一味追求囊胚移植可能会出现无可用胚胎周期取消的风险。因此，为了提高移植率和临床妊娠率，对于高龄患者，需要权衡利弊后选择合适的移植时机。本文回顾性分析2017 年1 月—2021 年1月在厦门大学附属妇女儿童医院行新鲜胚胎移植，年龄≥35 岁的832 例患者资料，通过分析实验室指标及临床结局，为高龄女性新鲜周期移植提供指导。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析本院行新鲜胚胎移植患者832 例的临床资料，按移植胚胎的发育天数分为D2 移植组（113 例），D3 移植组（685 例），D5 囊胚移植组（34例）。所需数据来源于厦门大学附属妇女儿童医院生殖医学科电子病历系统。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：女性年龄≥35 岁；行新鲜胚胎移植的体外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕患者。排除标准：囊胚移植前行囊胚活检者；接受供卵。

1.3 方法

1.3.1 促排卵及取卵 综合评估患者不孕原因及卵巢储备情况，制订合适的促排卵用药方案。根据阴道B 超监测卵泡发育情况及抽血查血清雌二醇（estradiol, E2）、黄体生成素（luteinizing hormone, LH）上升情况，个性化调整促性腺激素剂量和种类。当目标卵泡的直径达到18～20 mm 时注射重组人绒毛膜促性腺激素（艾泽，注册证号S20130091），36 h 后阴道超声取卵，获得的卵冠丘复合物（oocyte corona cumulus complex, OCCs）用配子缓冲液洗涤后置于受精培养液中，37.0℃，6%CO2培养。

1.3.2 体外培养及胚胎评估 男方精液液化后，根据精子浓度及活力选择密度梯度离心法或直接离心法优选处理，置于36.0℃，6%CO2培养箱。根据精液质量或既往体外受精（in vitro fertilization, IVF）助孕史选择合适的方式进行授精。

授精后16～18 h 进行原核观察，胞浆中有2 个原核为正常受精。授精后（44±1）h 和（68±1）h 进行D2及D3 胚胎观察，根据卵裂球数目、均匀程度，碎片、细胞核情况及其他异常情况（如胞质粗糙、空泡等）进行胚胎质量评估。D3 发育至7～9 个细胞，卵裂球大小较均匀，细胞质均一、无大空泡，无多核现象，碎片低于20%，为优质胚胎。D3 发育至6～12 个细胞，无多核现象，碎片低于30%，为可用胚胎。胚胎评估为1～3 级者均为可用胚胎，1～2 级为优质胚胎。D5 胚胎观察在受精后（116±2）h 进行，根据囊胚扩张程度、内细胞团（inner cell mass, ICM）及外滋养层（trophectoderm, TE）细胞数目及形态学进行评估。按照囊胚腔扩张程度分成1～6 期，根据ICM 和TE 细胞数分为A、B、C共3 个等级。3 期及以上囊胚，ICM 评级B 级以上(AA/BA/AB/BB/BC)为可用囊胚，其中ICM 及TE 评级为AA/BA/AB/BB 为优质囊胚。胚胎培养室的环境维持在室温24～26℃，湿度40～60%。胚胎培养液均用矿物油覆盖，放置于37℃，5%O2和6%CO2培养箱进行培养。

1.3.3 胚胎移植 新鲜胚胎移植一般在取卵后第3 日（D3）进行，如果行囊胚培养，则在第5 日（D5）移植。第2 天可用胚≤2 枚可选择在第2 日（D2）进行胚胎移植。腹部B 超引导下进行胚胎移植，术后即给予阴道用黄体酮阴道缓释凝胶（雪诺同，注册证号H20140552）1 支进行黄体支持。

1.3.4 临床随访判断 胚胎移植后第13、15 天化验血清中β 绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin, β-hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL，则为生化妊娠。隔日复查翻倍良好，于移植术后的第4～6周阴道超声检查有孕囊或见胎心搏动则为临床妊娠。孕12 周内自然流产视为早期流产。分娩活胎者视为活产。

1.4 观察指标

（1）比较3 组患者的基础资料，包括：年龄、体质指数（body mass index, BMI）、不孕年限、基础卵泡刺激素（basal fsh level, bFSH）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone, AMH）、窦卵泡数（antral follicle count, AFC）。

（2）比较3 组患者的促排卵及实验室指标，包括：促性腺激素（gonadotropins, Gn）的使用天数、Gn剂量、获卵数、2PN 受精率、可用胚数、优胚数、平均移植胚胎数。

（3）比较3 组患者的生化妊娠率、临床妊娠率、多胎率、早期流产率及活产率，计算公式如下。

①生化妊娠率=生化妊娠周期数/移植周期数×100%；②临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；③多胎率=≥2 个孕囊的妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；④早期流产率=孕12 周内流产周期数/临床妊娠周期数×100%；⑤活产率=分娩活胎周期数/移植周期数×100%。

1.5 统计方法

采用IBM SPSS 25.0 统计学软件进行数据处理，计量资料不符合正态分布者，采用中位数M（P25，P75）描述，使用K-W 检验进行比较；计数资料以频数和百分比（%）表示，采用χ2检验。以是否临床妊娠作为因变量，单因素分析具有意义或结合临床有意义的指标作为自变量，采用二元Logistic 回归模型输入法对影响临床结局的因素进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组患者一般资料比较

D2 移植组的年龄、bFSH 在3 组中最高，AMH、AFC 在3 组中最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。D5 移植组的年龄、bFSH 在3 组中最低，AMH、AFC在3 组 中 最 高，差 异 有 统 计 学 意 义（P＜0.05）。见表1。

表1 3 组患者一般资料比较[M（P25，P75）]

2.2 3 组患者促排卵及实验室指标比较

D2 移植组的获卵数、可用胚、优胚数在3 组中最低，差异有统计学意义（P＜0.05），D5 移植组的获卵数、可用胚数、优胚数在3 组中最高，差异有统计学意义（P＜0.05）；D3 移植组与D5 移植组的Gn 天数比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；D3 移植组的平均移植胚胎数在3 组中最高，D5 移植组最低，差异有统计学意义（P＜0.05）；3 组间Gn 剂量、2PN 受精率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3 组促排卵及实验室指标(±s)

表2 3 组促排卵及实验室指标(±s)

注：与D2 移植组比较，※P＜0.05；与D3 移植组比较，#P＜0.05

组别D2 移植（n=113）D3 移植（n=685）D5 移植（n=34）F 值P 值Gn 天数（d）9.7±0.2 9.6±0.1（10.2±0.2）#6.684 0.035 Gn 剂量（IU）2 730.3±58.9 2 787.5±24.7 2 719.5±106.6 0.925 0.630获卵数（个）（4.1±0.3）#（7.9±0.1）※（11.3±0.9）※#126.526＜0.001 2PN 受精率（%）69.9±0.03 75.7±0.01 75.6±0.03 2.725 0.256可用胚数（个）（2.0±0.1）# （4.6±0.1）※ （7.0±0.6）※#133.566＜0.001优胚数（个）（0.7±0.1）#（1.4±0.1）※ （2.9±0.4）※#37.890＜0.001平均移植胚胎数（枚）（1.6±0.04）# （1.8±0.02）※ （1.2±0.07）※#83.387＜0.001

2.3 3 组患者临床结局比较

D2 移植组的临床妊娠率及活产率在3 组中最低，差异有统计学意义（P＜0.05）；D5 移植组的临床妊娠率及活产率在3 组中最高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 3 组患者临床结局比较（%）

2.4 胚胎移植临床结局的Logistic 回归分析

移植胚胎的D5 移植、年龄以及移植胚胎数是影响临床妊娠的独立影响因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响不同发育天数胚胎移植临床结局的二元Logistic 回归分析

3 讨论

近几十年来，妇女推迟生育已经成为一个世界性的问题。辅助生殖技术在高龄产妇中的应用日益增多。研究表明，随着母体年龄的增长，与减数分裂相关的卵母细胞非整倍体的发生率显著增加[7-9]。在辅助生殖技术中，IVF 周期活产率与母亲年龄直接相关。美国疾病控制与预防中心最近的数据显示，2017年所有新鲜的、非捐赠者体外受精周期，＜35 岁女性的活产率为51.6%，这一比例随着女性年龄的增长而下降：35～37 岁为37.5%，38～40 岁时为23.5%，41～42岁时为11.8%，而≥43岁的女性不到3.4%[10]。

在体外受精与胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）技术中，多胚胎移植可增加活产的可能性。然而，多胎妊娠的风险也会增加，并伴有一系列严重的母婴并发症[11-12]。单个胚胎移植是减少多胎妊娠最直接的方法。近年来，囊胚培养和移植已广泛应用于大多数生殖中心。胚胎培养基优化以及培养技术的成熟为从卵裂期胚胎移植到囊胚期移植地转变提供了技术支撑。囊胚培养的基本原理是通过延长体外培养时间来进一步筛选更具发育潜力的胚胎，进一步排除具有遗传缺陷和高频率的非整倍体胚胎[13-14]。同时，囊胚与子宫内膜同步性更好，可减少异位妊娠[15-17]，使单个囊胚移植成为了在保持临床妊娠率的同时减少多胎妊娠的一种潜在有效方法。

本研究提示，与D2 和D3 移植相比，D5 囊胚移植是移植的首选。Sainte-Rose R 等[18]的最新研究报告也表明，体外延长培养对高龄女性是有利的。然而，囊胚培养并不适合所有患者[19]。对于获卵数少或可用胚数少的高龄患者，继续培养至D3 或者囊胚将有可能导致无可用胚、周期取消的风险。当前的挑战是如何前瞻性地选择合适的患者进行囊胚培养计划，以及对于每个患者来说，与卵裂期移植相比，这项技术是否会增加活产健康婴儿的可能性[20]。

本中心对于新鲜周期D2 天可用胚≤2 枚的患者采取的是D2 移植1～2 枚可用胚。对于大多数高龄女性主要是选取1～2 枚D3 胚移植。若D3 天胚胎数较多，则主要采取的是延长培养，移植1 枚D5 囊胚。本研究中D2 移植的临床妊娠率最低为30.09%，D5移植的临床妊娠率最高58.82%，Demián G 等[19]关于27 项RCT 研究报告也表明，新鲜囊胚移植后临床妊娠率显著升高（OR=1.30；95%CI:1.14～1.47；day 2～3:37.2%；day 5～6:43.2%；I2=56%），同时该报告指出使用新鲜卵裂期胚胎移植具有29%的活产率，而使用新鲜囊胚移植活产率为32%～42%，本文中D2、D3 和D5 移植的活产率分别是18.58%、33.28%和44.12%，两者的结果较为一致。Yang L 等[21]采用Time-lapse模型筛选单个D3 天胚胎移植与采用传统形态选择的单个D5 移植的持续妊娠率进行比较，结果显示D3 天的持续妊娠率显著低于D5 天，说明如果移植的胚胎数量一致，质量良好的囊胚与卵裂期胚胎相比，具有更高的临床妊娠率和活产率。

综上所述，胚胎的数量和质量是高龄女性选择移植时机的重要考虑标准。对于高龄女性，延长培养至囊胚阶段，进行D5 囊胚移植，可获得较高的临床妊娠率以及活产率。对于获卵数少，或可用胚少的患者，为患者争取移植机会，避免出现无可用胚胎周期取消的情况，选择D2 移植亦可获得一定的临床妊娠率及活产率。