TGF-β2、TGF-β3启动子甲基化在TCDD诱发小鼠腭裂过程中的作用

陈 露，陈 瑶，高 湛，刘小转，陶宇昌，余增丽

1)郑州大学第三附属医院保健部 郑州450052 2)郑州大学第五附属医院临床营养科 郑州 450052 3)郑州大学第五附属医院妇产科 郑州 450052 4)河南省人民医院单细胞研究中心 郑州 450003 5)河南省人民医院临床营养科 郑州 450003 6)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001

腭裂是人类最常见的出生缺陷之一，发病率为10.63/10 000活产儿[1]。环境和遗传因素的异常均可导致腭裂的发生。2，3，7，8-四氯二苯并对二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)是工业燃烧过程中产生的对人体和环境有害的持久性有机污染物。有报道[2]哺乳动物孕期接触过多TCDD可出现死产、流产、死胎以及包括腭裂在内的出生缺陷。近年来，表观遗传学在腭裂发生中的作用越来越受到重视。研究[3]发现表观遗传修饰参与TCDD诱导的腭裂过程，其中DNA甲基化被认为在腭裂形成过程中发挥了重要作用。转化生长因子(transforming growth factor,TGF)在哺乳动物腭发育过程中扮演重要角色[4]。研究[5-6]发现TGF-β2或TGF-β3基因敲除小鼠出现了包括腭裂在内的多种出生缺陷。因此，我们比较了正常和TCDD诱导的胎鼠腭组织中TGF-β2和TGF-β3启动子甲基化水平和基因表达水平，探讨TGF-β2以及TGF-β3启动子甲基化对TCDD诱导腭裂发生的潜在影响。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂63只6～8周龄C57BL/6N系成年小鼠(雄鼠21只，雌鼠42只)购于北京维通利华有限公司(合格证号No.1100111911039761、1100111911014659)。饲养条件为温度(20±2) ℃，湿度(50±5)%，光暗12 h交替。TCDD和二甲基亚砜购于美国Sigma公司，玉米油购于山东三星产业科技有限公司，中性蛋白酶购于上海罗氏制药有限公司，Trizol购于美国Life Technologies公司，反转录试剂盒购于大连宝生物工程有限公司，TGF-β2和TGF-β3抗体购于美国Pepro Tech公司，小鼠抗兔β-actin单克隆抗体购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 动物模型建立及分组63只小鼠在屏障环境内适应性饲养1周后，雌雄小鼠于晚8点按2∶1比例合笼，次日早8点查到阴栓则记为妊娠第0天(gestation day 0,GD0)，将42只孕鼠按照随机数字表法分为对照组(n=21)和TCDD组(n=21)，TCDD组于GD10用64 μg/kg的TCDD(用玉米油配制成10 mg/L)经口一次性灌胃，对照组以等体积玉米油一次性灌胃。

1.3 标本制备对照组和TCDD组孕鼠分别于GD13、GD14、GD15随机取3只颈椎脱臼处死，剖腹取胎鼠头部，用40 g/L多聚甲醛溶液固定6 h后，头喙部朝下，石蜡包埋切片；同法随机另取3只孕鼠的胎鼠，用眼科剪分离胎鼠腭突后，提取总RNA，用于TGF-β2和TGF-β3 mRNA表达的检测；每组余3只孕鼠于GD14提取胎鼠腭组织总DNA后进行甲基化检测。

1.4 胎鼠腭组织形态学观察石蜡切片经脱蜡、复水后行HE染色，后经脱水、透明、封片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.5 胎鼠腭组织中TGF-β2、TGF-β3 mRNA表达的qRT-PCR检测用Trizol提取胎鼠腭组织总RNA，分光光度计测定浓度和纯度，利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，制备PCR反应体系(共20 μL：cDNA 2.0 μL，SYBR 10.0 μL，引物1.6 μL，无RNase dH2O 6.4 μL)。扩增条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，64 ℃退火15 s，然后72 ℃延伸30 s，共40个循环。引物序列：TGF-β2上游5’-GCTGAGCGCTTTTCTGATCCT-3’，下游5’-CGAGT GTGCTGCAGGTAGACA-3’；TGF-β3上游5’-GGACTTCGGCCACATCAAGAA-3’,下游5’- TAGGGGACGTGGGTCATCAC-3’;内参β-actin上游5’-CTGT GCCCATCTACGAGGGCTAT-3’,下游5’-TTTGAT GTCACGCACGATTTCC-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.6 胎鼠腭组织中TGF-β2、TGF-β3启动子甲基化检测根据QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen公司)说明书提取胎鼠腭组织DNA并进行CpG位点甲基化检测。使用Sequenom公司Epidesigner (http://www.epidesigner.com)设计引物，见表1、2。亚硫酸氢盐处理胎鼠腭组织DNA并进行PCR扩增，反应体系9 μL，扩增条件：94 ℃ 10 min，94 ℃ 45 s，62 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(10个循环)；94 ℃ 45 s，57 ℃ 48 s，72 ℃ 1 min(35个循环)；72 ℃ 3 min。产物经碱性磷酸酶处理、纯化、点样，最后进行质谱分析，数据通过EpiTYPER软件(Sequenom公司)进行分析并输出结果。

表1 TGF-β2启动子甲基化检测的引物

表2 TGF-β3启动子甲基化检测的引物

1.7 统计学处理运用SPSS 19.0进行统计学处理。2组TGF-β2、TGF-β3启动子甲基化水平和mRNA相对表达量的比较均采用两独立样本的t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 2组胎鼠腭组织形态学观察结果见图1。GD13对照组和TCDD组胎鼠腭部形态无差异。GD14、GD15，对照组胎鼠双侧腭架抬高至舌体上方，并彼此接触融合；而TCDD组胎鼠双侧腭架太小以至于无法彼此接触融合，导致腭裂。

2.2 2组胎鼠腭组织TGF-β2、TGF-β3 mRNA相对表达量的比较见表3、4。与对照组相比，GD13～GD15 TCDD组胎鼠TGF-β2和TGF-β3 mRNA表达水平均降低。

A、C、E：对照组GD13、GD14、GD15；B、D、F：TCDD组GD13、GD14、GD15

表3 2组胎鼠腭组织TGF-β2 mRNA的相对表达量(n=3)

表4 2组胎鼠腭组织TGF-β3 mRNA的相对表达量(n=3)

2.3 2组GD14胎鼠腭组织中TGF-β2、TGF-β3启动子甲基化水平比较见表5～9。2组TGF-β2和TGF-β3整体甲基化程度比较，差异均无统计学意义。但是与对照组相比，TCDD组TGF-β2的CpG10、CpG32.33.34位点甲基化水平降低，CpG14、CpG18.19、CpG25和CpG29甲基化水平升高；TGF-β3中CpG2.3、CpG16.17.18、CpG6甲基化水平升高，而CpG18甲基化水平降低。

表5 2组胎鼠TGF-β2、TGF-β3整体甲基化水平比较(n=3) %

表6 2组胎鼠TGF-β2片段1甲基化水平比较(n=3) %

表7 2组胎鼠TGF-β2片段2甲基化水平比较(n=3) %

表8 2组胎鼠TGF-β3片段1甲基化水平比较(n=3) %

表9 2组胎鼠TGF-β3片段2甲基化水平比较(n=3) %

3 讨论

本研究中我们利用TCDD构造胎鼠腭裂模型，评估胎鼠腭组织中TGF-β2和TGF-β3的表观遗传调控及其在TCDD诱导腭裂过程中的作用。HE染色结果显示TCDD组腭发育异常，这与先前的研究[7]结果一致。由于GD14是胎鼠腭发育过程中双侧腭架接触融合的关键节点[8-9]，我们选取GD14胎鼠腭组织DNA进行TGF-β2和TGF-β3启动子甲基化分析，结果显示，尽管对照组和TCDD组TGF-β2、TGF-β3启动子整体甲基化水平差异无统计学意义，但启动子个别位点甲基化水平差异有统计学意义。有证据[10-11]表明，启动子区CpG位点甲基化可以抑制基因表达，去甲基化则激活基因表达。本研究结果显示，TGF-β2两个片段共6个位点发生变化，其中4个位点甲基化水平升高，2个位点甲基化水平降低；TGF-β3两个片段共4个位点发生变化，其中3个位点甲基化水平升高，1个位点甲基化水平降低。本研究中TCDD组胎鼠腭组织中TGF-β2和TGF-β3 mRNA相对表达量低于对照组。因此，我们推测TCDD导致的TGF-β2和(或)TGF-β3基因表达降低，可能与TGF-β2和(或)TGF-β3启动子部分位点甲基化有关。

TGF-β2在胎鼠腭组织中的表达水平降低，这似乎并不足以引发腭裂，因为此前在TGF-β2基因敲除小鼠中腭裂仅表现出低于25%的外显率[6]。Fox2基因敲除模型显示腭架发育不良，作者间接地将其归因于TGF-β2表达下降及Smad信号通路的作用[12]。综上，我们推测TGF-β2可能不直接参与腭架的生长。

有研究[5]发现TGF-β3基因敲除小鼠表现出以中线上皮缝持续存在为特征的腭部融合失败导致的腭裂，体外实验[13]中也发现高剂量TCDD可使腭突间充质细胞中TGF-β3表达降低。本研究结果显示，TCDD组胎鼠腭组织中TGF-β3 mRNA表达降低。由此我们推测，TGF-β3的表达降低似乎更有可能干扰了双侧腭部融合而不是阻碍腭架的生长。

综上，TCDD可能通过诱导启动子部分位点发生甲基化影响TGF-β2和(或)TGF-β3在腭架中的表达，进而影响腭架的生长(间接或直接通过TGF-β2)以及双侧腭部融合(直接通过TGF-β3)，从而导致腭裂的发生。本研究只探讨了TGF-β2和TGF-β3基因水平的改变，未来我们将继续深入探讨蛋白水平的机制。