牙龈卟啉单胞菌感染及PDCD4低表达对食管癌细胞紫杉醇化疗的影响

李若楠，刘怡文，杨 洪，孔金玉，孙 蔚，高社干

1)河南科技大学第二附属医院重症医学科 河南洛阳 471000 2)河南科技大学临床医学院；河南科技大学第一附属医院；河南科技大学肿瘤研究所；河南省肿瘤表观遗传重点实验室 河南洛阳 471003 3)河南科技大学信息工程学院 河南洛阳 471003 4)河南科技大学体育学院 河南洛阳 471003

食管癌发病率与死亡率高，早期多表现为消化系统疾病的一般症状，易被忽略，确诊时多发展至晚期，5 a生存率低于20%[1]。作者在前期研究[2]中发现牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)在上消化道肿瘤中呈上高下低的分布且与食管癌的发生发展密切相关，但其具体致病机制尚不完全明确。研究[3]显示，多种病原微生物均能通过调控宿主细胞凋亡相关蛋白重塑肿瘤微环境，为自身长期定植提供有利条件。程序性细胞死亡因子4(programmed cell death factor 4，PDCD4)是细胞凋亡过程中的关键调控因子，可通过阻止蛋白质翻译促进细胞凋亡，与多种肿瘤的发生发展有关，且PDCD4下调或缺乏可使肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)干性增强[4]。CSC是存在于肿瘤中具有高度自我更新和异常分化潜能的一小部分细胞亚群[5]。尽管传统放化疗对肿瘤有一定的治疗效果，但临床数据显示CSC对各种治疗均具有抗性，CSC已被认为是肿瘤耐药、复发和转移的根源[6]。目前已证实乙醛脱氢酶1(acetaldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)是食管癌优选的干细胞标记物[7]。

本研究首先建立PDCD4敲降的食管癌细胞系，分别用Pg感染亲本与敲降细胞，探讨Pg与PDCD4在食管癌紫杉醇(paclitaxel，PTX)化疗抵抗中的作用及可能的分子机制，为食管癌的临床治疗提供新思路和治疗手段。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂与仪器人食管癌KYSE30细胞系及293T细胞系(上海弘顺生物科技有限公司)。4～6周龄健康SPF级BALB/c雄性裸鼠，体重约20 g(中国常州卡文斯实验动物有限公司)，动物许可证号：SCXK(苏)2016-0010。Pg菌株ATCC 33277(美国路易斯维尔大学口腔生物实验室捐赠)。GAM肉汤培养基、体积分数5%脱脂绵羊血、氯化血红素和维生素K(中国索莱宝公司)，RPMI 1640、opti-MEM及DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，慢病毒包装试剂盒(GeneCopeia公司)，PTX(美国Selleck Chemicals公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁公司)，ALDEFLUORTM干细胞检测试剂盒(加拿大Stemcell Technologies公司)，PKH67细胞荧光标记试剂盒(美国Sigma-Aldrich公司)，PDCD4、ALDH1和内参GAPDH抗体(美国Abcam公司)，二抗和BCA蛋白定量试剂盒(中国康为世纪生物科技有限公司)，PVDF膜(美国Millipore公司)，ECL发光显影液(美国Invitrogen公司)。凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)，倒置光学显微镜(日本尼康公司)，PE小动物活体光学成像系统(美国珀金埃尔默公司)，流式细胞仪(美国贝克曼公司)，厌氧工作站(美国COY公司)。

1.2 PDCD4敲降KYSE30细胞系的建立293T细胞用含体积分数10%胎牛血清(56 ℃热灭活30 min)的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中常规培养至密度达60%～70%。由GeneCopeia公司设计PDCD4敲降质粒(PDCD4-DNA)，根据慢病毒包装试剂盒说明配制PDCD4-DNA-EndoFectin 混合物,室温中放置30 min后，将混合物加入293T细胞中,常规培养12 h更换为新鲜培养基，加入滴度增强剂。常规培养48 h后，收取病毒上清，用0.45 μm滤器过滤。待KYSE30细胞密度至50%～60%时，加入病毒上清，用嘌呤霉素筛选培养2周。提取细胞蛋白，通过Western blot法检测PDCD4表达水平，评估敲降效率。将PDCD4敲降后的细胞命名为KYSE30-P。

1.3 实验分组Pg菌株用含体积分数5%脱脂绵羊血、10 g/L氯化血红素和10 g/L维生素K的GAM肉汤培养基，于37 ℃、体积分数85%N2、10%H2和5%CO2厌氧工作站中常规培养。利用革兰染色法及哥伦比亚血琼脂板检测Pg的纯度。选取活力较好的Pg菌液(OD600 nm=1～2)，待KYSE30或KYSE30-P细胞密度为 60%～70%时，按感染复数MOI=10将Pg加入细胞培养基，感染时间为24 h，将Pg感染后的细胞命名为KYSE30+Pg与KYSE30-P+Pg，未感染细胞KYSE30和KYSE30-P为对照。

1.4 4组细胞PTXIC50的检测采用CCK-8法检测KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg细胞PTX作用24 h的IC50。取96孔板，每孔加100 μL细胞悬液，约1 000个细胞，预培养24 h。每组细胞均用不同浓度的PTX(从0 mg/L开始，每增加0.5 mg/L设置1个浓度，直至30.0 mg/L)培养24 h。每孔加入CCK-8试剂10 μL，1 h后酶标仪测定OD450 nm，计算IC50。实验重复3次。

1.5 4组细胞中PDCD4及ALDH1蛋白表达的检测提取KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg组细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测浓度并定量。每泳道上样量30 μg总蛋白，SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上。用含50 g/L 脱脂牛奶的TBST室温封闭1 h，TBST洗膜后，加入一抗PDCD4、ALDH1(1∶1 000 稀释)和内参GAPDH(1∶2 000稀释)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后，加入二抗(1∶2 000稀释)室温孵育2 h。TBST洗膜后，ECL发光显影，凝胶成像系统采集图像，并应用Image Lab软件对条带灰度值进行分析。以目的条带与内参条带灰度值比值为目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.6 4组细胞中CSC百分比的检测用ALDEFLUORTM检测缓冲液将4组细胞(KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg及KYSE30-P+Pg)的密度均调整至1×106个/mL。每组抽取1 mL细胞悬液放入检测管中，对照管中加入5 μL二乙氨基苯甲醛试剂。检测管中加入5 μL活化的ALDEFLUORTM试剂混合均匀，并立即抽取0.5 mL混合物加入对照管中。37 ℃孵育30 ～ 60 min。250×g离心5 min，弃上清。用0.5 mL ALDEFLUORTM检测缓冲液重悬细胞沉淀，上流式细胞仪检测ALDH1标记的阳性细胞(CSC)。以检测管与对照管中CSC百分比的差值为最终CSC百分比。实验重复3次。

1.7 裸鼠皮下荷瘤实验24只BALB/c裸鼠适应性饲养1周后，随机分为4组：KYSE30组、KYSE30-P组、KYSE30+Pg组与KYSE30-P+Pg组，每组6只。用PKH67荧光标记KYSE30、KYSE30-P、KYSE30+Pg与KYSE30-P+Pg细胞。裸鼠皮肤消毒后，按分组于每只裸鼠右侧腋下接种标记后的细胞5×106个。接种后2周，各组裸鼠皮下肿瘤长至直径0.5～1.0 cm。之后每3 d尾静脉注射一次PTX，剂量为10 mg/kg，共给药6次[8]。最后一次给药后3 d用小动物活体成像仪拍摄并测量肿瘤大小，然后用戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，颈椎离断法处死，剥离瘤体称重。一部分瘤体用于检测PDCD4及ALDH1蛋白的表达情况，另一部分研磨后配制成单细胞悬液，用于检测CSC百分比，方法同前。

1.8 统计学处理应用SPSS 23.0处理数据。采用两独立样本t检验比较KYSE30细胞与KYSE30-P细胞中PDCD4表达量的差异。采用2×2析因设计的方差分析探讨PDCD4敲降或Pg感染对KYSE30细胞中PDCD4蛋白、ALDH1蛋白、CSC百分比及PTXIC50的影响，以及PDCD4敲降或Pg感染对裸鼠PTX化疗敏感性、成瘤能力及裸鼠瘤体组织PDCD4、ALDH1蛋白及CSC百分比的影响。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PDCD4敲降的KYSE30细胞系的建立采用PDCD4-DNA敲降质粒及慢病毒包装试剂盒构建PDCD4敲降的KYSE30细胞系，结果(图1、表1)显示，与KYSE30细胞(1.61±0.07)相比，KYSE30-P细胞中PDCD4表达量(0.17±0.02)降低(t=19.331，P=0.001)，表明成功建立PDCD4敲降的KYSE30-P细胞系。

2.2 Pg感染及PDCD4敲降对KYSE30细胞PDCD4、ALDH1蛋白表达，CSC百分比及PTXIC50的影响Pg感染与PDCD4敲降均可降低KYSE30细胞中PDCD4蛋白表达量，升高ALDH1蛋白表达量、CSC百分比及PTXIC50，且Pg感染与PDCD4敲降存在协同作用(图2、表1)。

1：KYSE30细胞；2：KYSE30-P细胞

1～4：分别为KYSE30组、KYSE30-P组、KYSE30+Pg组、KYSE30-P+Pg组

表1 4组细胞中PDCD4蛋白、ALDH1蛋白、CSC百分比及PTX IC50的比较

2.3 Pg感染及PDCD4敲降对裸鼠PTX治疗效果的影响结果(图3、表2)显示：Pg感染与PDCD4敲降均可降低裸鼠瘤体对PTX敏感性，增强成瘤能力，且二者存在协同作用。

图3 活体成像检测各组裸鼠瘤体大小及荧光强度

表2 各组裸鼠瘤体荧光强度及质量的比较

2.4 Pg感染及PDCD4敲降对裸鼠瘤体内PDCD4、ALDH1蛋白表达及CSC百分比的影响结果(图4、表3)显示：Pg感染与PDCD4敲降均可降低裸鼠瘤体内PDCD4蛋白表达量，升高ALDH1蛋白表达量及CSC百分比，且二者存在协同作用。

1～4：分别为KYSE30组、KYSE30-P组、KYSE30+Pg组、KYSE30-P+Pg组

表3 各组裸鼠瘤体内PDCD4、ALDH1蛋白及CSC百分比的比较

3 讨论

化疗对于中晚期食管癌患者至关重要，其中PTX已被证实为反应良好的化疗药物之一，但易产生耐药[9]。因此，寻找食管癌PTX耐药的分子机制对于改进食管癌治疗方法、提高临床疗效具有极其重要的意义。我们前期研究[10]证实Pg可长期定植于食管癌组织，促进其恶性进展，且Pg感染阳性的食管癌患者PTX化疗效果并不理想，但其具体机制尚不完全明确。

研究[11]显示，多种病原微生物均能通过调控宿主细胞凋亡相关蛋白，增强肿瘤细胞恶性增殖能力，降低其对化疗药物的敏感性。如幽门螺杆菌可通过抑制PDCD4表达，促进胃癌细胞上皮间质转化，增强其侵袭能力及抗凋亡能力；HPV可通过抑制宫颈癌细胞PDCD4活性，阻断癌细胞程序性凋亡，促进其恶性增殖[12]；EB病毒可通过降低PDCD4活性，抑制鼻咽癌细胞凋亡，协助其顺铂化疗抵抗[13]。PDCD4是细胞凋亡过程中至关重要的抑癌基因，可与真核细胞翻译起始因子偶联，抑制核糖体复合物形成，阻止蛋白质翻译，促进细胞凋亡。资料[14]显示，食管癌、胃癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、宫颈癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤中PDCD4表达均下调。本研究发现，Pg感染与PDCD4敲降均可引起KYSE30细胞中PDCD4蛋白表达降低及PTXIC50增高，提示Pg感染可抑制KYSE30中PDCD4表达，而PDCD4低表达可削弱KYSE30对PTX的敏感性；PDCD4可能为Pg感染引起的PTX化疗抵抗中的关键负反馈调节因子。

此外，PDCD4表达下调与CSC干性的维持密切相关[15]。PDCD4表达下调可促进肝脏CSC迁徙和转移[16]。PDCD4缺乏可导致脂肪源性干细胞(ADSC)的干性增强，促进ADSC的增殖和集落形成能力[17]。目前的治疗手段(放、化疗)主要针对已分化的细胞，但恰恰这些数量极少的CSC决定了恶性肿瘤的发生、侵袭、转移及对治疗的敏感性[18]。CSC的检测与分选已成为肿瘤治疗的关键。ALDH1是一种将醛类氧化成羧酸类的依赖烟酰型辅酶的乙醛脱氢酶，具有高度氧化活性，参与基因表达、组织分化和维持内环境稳定等[19]。研究[20]已证实ALDH1是结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、膀胱癌、肺癌等多种肿瘤优选的CSC标志物，且其高表达与患者的预后不良密切相关。本研究发现，PDCD4敲降或Pg感染均可抑制食管癌细胞或食管癌裸鼠移植瘤瘤体中PDCD4表达，促进ALDH1蛋白表达及CSC增多，导致PTX化疗抵抗。

综上所述，Pg感染或PDCD4敲降均可诱导食管癌细胞中CSC富集及PTX耐药，且二者联用可能具有协同作用，有效清除Pg并活化PDCD4可能为食管癌的治疗提供新策略或手段。