利用人气道基底细胞体外构建类气管球

张文平，刘 姿，贾建超，魏 立，张晓菊

1)河南省人民医院(郑州大学人民医院；河南大学人民医院)呼吸与危重症医学科 郑州 450003 2)河南省人民医院(郑州大学人民医院；河南大学人民医院)胸外科 郑州 450003

人气道基底细胞存在于气管和直径大于1 mm的支气管上皮内，是肺内源性干细胞的一种。研究[1]表明气道基底细胞中存在多能干细胞，其可随机分化为分泌细胞和纤毛细胞，维持细胞数量的稳定。这一特点决定了人气道基底细胞在肺损伤修复中发挥一定的作用。利用人气道基底细胞生成的类气管球成熟后由复层纤毛细胞、分泌黏蛋白的杯状细胞和基底细胞组成[2]。由气道基底细胞体外培养获得的类气管球可用于研究调节基底细胞增殖和分化的小分子和药物，也可用于研究治疗纤毛细胞和分泌细胞比例失调疾病(哮喘、慢性阻塞性肺疾病和囊性纤维化等)的新方法。本研究应用人气道基底细胞构建类气管球，并观察不同来源的基底细胞所形成类气管球的差别。

1 材料与方法

1.1 材料肺组织来源于河南省人民医院肺移植中心肺移植手术弃用的供肺。主要试剂：含谷氨酰胺DMEM培养液(Gibco公司),EpiX Base培养基(Propagenix 公司)，Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培养基(Thermo Fisher公司)，胶原酶P、蛋白酶ⅩⅣ、DNA酶Ⅰ、胶原蛋白溶液、KRT5单抗、PKH26荧光细胞膜染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司)，基质胶(Corning公司)，p63-α(D2K8X) XP®兔单抗(Cell Signaling Technology公司)，MUC5A 单抗、FOXJ1单抗、山羊抗鸡 488抗体、山羊抗鼠555(Thermo Scientific公司),山羊抗兔647抗体(Novus Biologicals公司)。自动细胞计数仪2000(Nexcelom Biosicence公司)，倒置显微镜，倒置荧光显微镜，激光共聚焦显微镜。

1.2 原代人肺成纤维细胞的分离培养于超净工作台使用无菌手术剪将肺组织(来自一名77岁男性，无肺部基础疾病)剪成细小碎片(约1 mm3)，加入0.5 g/L胰蛋白酶-EDTA酚红，37 ℃水浴10 min后用无菌纱布过滤，滤液1 600 r/min离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液5 min后离心，以完全培养基重悬，1 600 r/min离心5 min，弃上清，再重悬细胞。将所得细胞悬液接种于培养瓶中，以Ham′s F-12 Nutrient Mix完全培养基培养，所得细胞为肺成纤维细胞。细胞融合度80%左右时可进行传代。细胞保存于含体积分数10%二甲基亚砜的胎牛血清中，液氮罐内长期保存。

1.3 人气道基底细胞的分离培养使用酶消化法从人气管或支气管标本分离气道基底细胞。第1天以蛋白酶和DNA酶Ⅰ消化气管和支气管组织，第2天以手术刀片轻轻搔刮气管或支气管内膜，收集细胞接种于胶原蛋白溶液包被的T75或T175长颈培养瓶，用EpiX Base培养基，在体积分数5%CO2、37 ℃培养48 h。所得细胞经KRT5和P63免疫荧光染色鉴定为气道基底细胞。细胞融合度达80%左右时可进行传代。建议人气道基底细胞保存于第一代。

1.4 类气管球的体外培养与鉴定所有操作均在超净工作台内完成。取24孔板，每孔用100 μL体积比1∶1混合的基质胶与EpiX Base培养基包被，冰上操作。然后将24孔板置于37 ℃温箱中30 min使凝胶固化。

使用PKH26预染人肺成纤维细胞胞膜(红色)，以在荧光显微镜下区分气道基底细胞和肺成纤维细胞。冰上分别将气道基底细胞、肺成纤维细胞重悬于冷的EpiX Base培养基中，充分混匀，调整细胞密度为1×106个/mL。将100 μL细胞悬液(含基底细胞及肺成纤维细胞各5×104个)与等体积基质胶混匀，所得细胞悬液接种于24孔板，每孔200 μL。将培养板置于37 ℃温箱30 min，待凝胶固化后每孔加入700 μL EpiX Base培养基，置于体积分数5%CO2温箱、37 ℃培养。隔日更换EpiX Base培养基。定期观察细胞形态及有无类气管球形成。以单独培养的基底细胞或肺成纤维细胞为对照。

弃去培养基，每孔加入福尔马林1 mL静置2 h。将固定后的类气管球转移到离心管内，400×g离心6 min。加1 mL体积分数0.3%Triton-X100室温下透化1 h，400×g离心6 min，弃上清。加30 g/L牛血清白蛋白(溶于PBS)室温下封闭1～2 h，400×g离心6 min，弃上清。以200 μL PBS重悬，转移至玻璃底的24孔板内，每孔10 μL。加一抗KRT5(1∶1 000稀释)、P63-α(1∶800稀释)、MUC5A(1∶150稀释)、FOXJ1(1∶200稀释)，4 ℃过夜。加二抗山羊抗鸡488、山羊抗鼠555、山羊抗兔647抗体(均按1∶2 000稀释)，室温1 h，400×g离心6 min。然后以DAPI复染细胞核。

1.5 老年株、青年株基底细胞类气管球形成效率的比较分离青年和老年健康供者的气道基底细胞和肺成纤维细胞，方法同上。分别将青年株、老年株气道基底细胞和青年株、老年株肺成纤维细胞共培养，观察形成的类气管球的大小和数量。联合培养前气道基底细胞老年株细胞活性为71.6%，青年株为84.0%，人肺成纤维细胞老年株活性为93.0%，青年株为90.0%。

2 结果

2.1 类气管球的镜下表现培养第11天，气道基底细胞单独培养或与肺成纤维细胞联合培养均可见类气管球形成，肺成纤维细胞单独培养无类气管球形成(图1)。气道基底细胞与肺成纤维细胞联合培养形成的类气管在镜下呈球形，随着培养时间延长球体直径逐渐增大，14～21 d时达峰值。

A、B、C：分别为气道基底细胞与肺成纤维细胞共培养、气道基底细胞单独培养、肺成纤维细胞单独培养；1、2：分别为亮视野和暗视野，暗视野下B2未见红色荧光，说明无肺成纤维细胞

2.2 类气管球的细胞组成气道基底细胞所形成的类气管球结构示意图见图2A，类气管球表面为基底细胞，纤毛细胞和分泌细胞分布在管腔内。免疫荧光染色可见基底细胞(KRT5+P63+)分布于类气管球体表面，纤毛细胞(FOXJ1+)和分泌细胞(MUC+)分布在管腔内部(图2B、C)；纤毛细胞和分泌细胞均由基底细胞分化而来。

A：类气管球示意图；B：类气管球外部分布着表达KRT5(绿色荧光)和P63(红色荧光)的基底细胞(免疫荧光染色，×400)；

2.3 老年株、青年株基底细胞类气管球形成效率的比较来源于青年和老年健康供者的气道基底细胞分别与来源于青年和老年健康供者的肺成纤维细胞共培养，可以观察到形成类气管球的大小和数量存在区别(图3)；全视野下(图4)可见，培养第20天，与基底细胞青年株相比，基底细胞老年株与成纤维细胞联合培养所形成的类气管球直径更大，数量更多。

3-1、3-2：气道基底细胞老年株分别与肺成纤维细胞青年、老年株共培养，箭头所示球体或类球体为类气管；3-3、3-4：气道基底细胞青年株分别与肺成纤维细胞青年、老年株共培养，箭头所示球体或类球体为类气管

A、B：气道基底细胞老年株(Basal Cell Old)分别与肺成纤维细胞青年株(hLF Young)及肺成纤维细胞老年株(hLF Old)共培养20 d；C、D：气道基底细胞青年株(Basal Cell Young)分别与hLF Young及hLF Old共培养20 d

3 讨论

目前体外类肺器官可提供研究细胞间相互作用的平台，也是体外合成可植入气道组织治疗慢性肺部疾病的第一步。人气道基底细胞中存在多能干细胞，可随机分化为分泌细胞和纤毛细胞，维持细胞数量的稳定，在肺损伤修复过程中发挥作用。原代人气道基底细胞的分离常采用以下3种临床标本：①因挫伤严重或感染废弃不用的肺移植供肺或单肺移植时非手术侧的供肺、供肺减容的部分。②切除的病肺。③支气管镜检查时刷检或活检标本。前两种标本可用于实验室研究，并建立细胞库。用第3种方法获取的标本体外与不能进行有丝分裂的肺成纤维细胞在Rho激酶抑制剂存在的情况下共培养，可快速扩增气道基底细胞，用于人工气管的生物工程临床研究[3]。

本研究利用废弃供肺的气管或支气管分离人气道基底细胞，利用肺组织分离成纤维细胞。人气道基底细胞非常敏感，在分离和培养过程中应严格按照操作方案要求，尤其应注意以下几点：①严格遵守各步骤对温度、时间、转速等的要求。②在使用无菌手术刀搔刮气管或支气管内膜时避免过深突破基底膜，以避免其他类型细胞的污染。③由于肺是开放器官，在基底细胞分离培养过程中应注意到污染的概率较大。④由于基底细胞具有分化能力，建议保存第一代细胞用于研究。

本研究结果表明类气管球可由基底细胞单独培养生成，也可由基底细胞和肺成纤维细胞共培养生成；免疫荧光染色证实类气管球表面分布着基底细胞，腔内可见纤毛细胞和分泌细胞。既往文献[2,4]报道，人肺成纤维细胞和气道基底细胞共培养，或在培养基中添加Rho激酶抑制剂可将类器官形成的效率由10%提高到20%。在类器官培养体系中，肺成纤维细胞缺失时，肺上皮细胞的自凝聚现象减弱，且无法形成管状结构。抑菌素、Rho激酶抑制剂Y27632、肌动蛋白聚合细胞松弛素D均具有影响肌动球蛋白介导收缩的作用，从而促进体外类器官形成管状结构并使其体积增大[5-6]。

有趣的是，本研究发现气道基底细胞老年株与人肺成纤维细胞老年株或青年株共培养均较基底细胞青年株形成类气管的数量多且体积大，但仍需要更多细胞株，并优化计数、直径测量方法，进一步比较证实，具体机制也需要进一步研究。结合Mou等[7]的研究，转化生成因子β(TGFβ)/骨形态发生蛋白(BMP)/SMAD信号通路在气道基底细胞的增殖和分化过程中起重要作用；SMAD磷酸化可促进基底细胞的分化，敲除TGFβ/BMP基因和抑制药物均可阻碍基底细胞分化为纤毛细胞和分泌细胞。气道基底细胞的老年株和青年株可能在TGFβ/BMP/SMAD信号通路的基因表达和调节方面存在一定差异，可进行相关的研究进一步探讨。

体外类肺器官是一个较新的研究领域。本研究成功在体外构建了类气管球模型，其可在体外模拟气道生理，为气道的发生发育、生理和疾病相关研究提供模型支持。