ABCC2基因单核苷酸多态性对食管鳞癌术后患者无病生存期的影响

曹放，孙志伟，史幼梧，孙婧，杜丰，肖艳洁，余靖，贾军，杨颖△

食管癌是严重威胁人类健康和生命的疾病。最新统计数据显示，2015 年我国新发食管癌47.79 万例，死亡37.5 万例，位列癌症发病第3 位，死亡第4位［1］。鳞状细胞癌是食管癌主要的病理组织学类型，约占全部食管癌的90%［2］。食管鳞状细胞癌预后较差，5年生存率不足20%［1-2］。目前多采用手术、放疗、系统治疗（如化疗及免疫治疗等）、介入治疗以及射频消融等多种治疗手段，以期改善患者的生活质量，延长生存期。尽管外科技术不断进步，且新辅助化疗、辅助化疗及围手术期放化疗等围手术期治疗方式日益完善，术后仍有28%~74%的患者复发［3］。探索术后患者复发的相关因素，可以为患者个体化治疗，改善预后提供一定的依据。

一直以来，基因突变和基因多态性都是探索个体化治疗和精准医疗的热点。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是常见的基因变异形式，可能与癌症的发生、发展及预后相关，是个体罹患疾病及生存差异的基础。食管鳞癌患者的围手术期治疗多以紫杉醇为主。结合临床实践需要，参考已发表的研究结果，本研究以紫杉醇药代动力学通路为基础［4］，探讨ATP 结合盒亚家族（ATP binding cassette subfamily，ABC）B 成员1（ABCB1）、ABCG2、ABCC1 及ABCC2 这4 个基因的SNP 对食管鳞癌患者术后无病生存期的影响，旨在为手术患者提供新的生物标志物以评估预后，并根据不同的复发风险进行个体化管理与治疗。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2010年9月—2018年12月北京大学肿瘤医院肿瘤内科VIP2 病区收治的227例食管鳞癌患者。排除晚期、未接受手术、未接受围手术期治疗或围手术期未接受紫杉醇治疗的患者，最终纳入77例围手术期接受紫杉醇治疗的食管鳞癌根治术患者作为研究对象。鳞癌的诊断以术后的病理诊断为准。所有患者均签署书面知情同意书，同意出于科学研究的目的，对其生物学样本进行检测并采集其医疗记录进行分析。本研究得到了北京大学肿瘤医院伦理委员会的批准（伦理批件号2016KT91）。

1.2 研究方法

1.2.1 研究设计及SNP选择 本研究为预后研究，研究设计为回顾性队列研究。采集患者静脉血并保存在-92 ℃冰箱中。研究选择的SNP 均来自美国国家生物技术信息中心SNP 数据库（National Center for Biotechnology Information SNP database），符合以下条件的SNP最终被纳入研究：（1）中国人群中次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）≥20%。（2）基因分型检出率（genotying call rate）≥95%。（3）基因连锁不平衡系数r2＜0.8。（4）优先选择位于基因转录区域的错义SNP，即基因外显子区域，其次选择同义SNP，最后是内含子SNP。最终7个SNP被确定为研究对象，即ABCB1 rs1045642、rs2032582、rs3213619，ABCG2 rs2231137、rs2231142，ABCC1 rs246221和ABCC2 rs3740066，见表1。

根据人群中基因分布频率的不同，等位基因分为主要型（A）和次要型（a）；基因型分为主要等位基因纯合型（AA）、杂合型（Aa）和次要等位基因纯合型（aa）。Aa、aa 分别与AA 比较的方法，称为基因加性模型；将杂合型及次要等位基因纯合型之和（Aa+aa）与AA 比较的方法，称为基因显性模型；将aa与AA+Aa比较的方法，称为基因隐性模型。

Tab.1 Characteristics of selected single nucleotide polymorphisms表1 纳入研究的单核苷酸多态性的特征

1.2.2 基因测序分型 采用MassARRAYTMMaldi-tof 系统（Sequenom,Inc.）进行SNP基因测序分型。采用MassARRAYTMAssay Design 软件设计聚合酶链反应（PCR）扩增的引物和单碱基延伸引物（表2），采用MassARRAYTMCompac 分析仪进行质谱检测。约5%的样本行重复检测用于质量控制。

Tab.2 Primer sequence of selected single nucleotide polymorphisms表2 单核苷酸多态性基因测序的引物序列

1.2.3 收集指标 收集患者年龄、性别、吸烟史、饮酒史、食管病变位置以及是否为多原发病变等信息。无病生存期（disease-free survival，DFS）是指从根治术后到第一次复发或因任何原因导致死亡之间的时间。复发的确认以影像学诊断结合临床实际为准。对复发患者的随访以门诊访视为主，同时结合电话及微信随访，所有复发的影像学报告均以纸质版形式存档。

1.3 统计学方法 所有统计分析均采用SAS v9.4 软件（SAS Institute Inc.，Cary，NC）进行。分别以遗传加性模型、显性模型和隐性模型进行SNP分析。首先应用比例风险回归模型，即Cox回归模型评估遗传变异对无病生存的影响，然后校正年龄和性别行进一步分析。研究结果以粗风险比（crude hazard ratio，cHR）、校正风险比（adjusted HR，aHR）及其95%置信区间（CI）表示。多次检验和小样本量可能导致研究结果假阳性，本研究采用半贝叶斯收缩方法（semi-Bayesian Shrinkage）进行调整和验证［5］。由于缺乏生物机制研究，且流行病学证据有限，因此先验系数选择均值0、方差1.92的正态分布，即指数化后先验HR=1.000，先验95%CI为0.250~4.000。

2 结果

2.1 一般临床特征 在本研究中，77例食管鳞癌术后患者年龄59（54，62）岁，男62例（80.5%）。52例（67.5%）有吸烟史，51例（66.2%）有饮酒史。10例（13.0%）为多原发病变，其余67例单发病灶患者中，3例（4.5%）位于食管胸上段，13例（19.4%）位于胸中段，51例（76.1%）位于胸下段。所有患者均接受了一种甚至多种围手术期治疗，包括新辅助治疗38例（49.4%），辅助化疗31例（40.3%），辅助放化疗22例（28.6%）。术后64例（83.1%）患者复发，13例患者无复发（16.9%），中位DFS为368（194，776）d。

2.2 临床特征对DFS的影响 将患者年龄（连续变量）、性别（男=0，女=1）、吸烟史（无=0，有=1）、饮酒史（无=0，有=1）、食管病变位置（胸下段=0，胸上中段=1）以及是否为多原发病变（否=0，是=1）等信息与SNP（加性模型：野生型=0，杂合型=1，纯合型=2；显性模型：野生型=0，其他=1；隐性模型：纯合型=1，其他=0）作为自变量纳入研究，以是否复发（无复发=0，复发或因任何原因导致死亡=1）为因变量，进行Cox 回归分析。结果显示，未发现性别、年龄、肿瘤位置及吸烟、饮酒史等与DFS有关，见表3。

2.3 SNP 对DFS 的影响分析 在显性基因模型下，ABCC2 rs3740066的次要等位基因与DFS缩短有关。在校正性别和年龄后，该关联仍有统计学意义［cHR（95%CI）=4.623（1.111~19.241），P=0.035；aHR（95%CI）=4.290（1.010~18.215），P=0.048］，即 含ABCC2 rs3740066 的次要等位基因T 的患者复发危险较野生型提高3倍以上。其他基因的SNP在各个基因模型下，以及ABCC2 rs3740066 在其他基因模型下，均未发现有统计学意义的关联性。见表4。

Tab.3 Analysis of the influence of clinical characteristics on disease-free survival表3 临床特征对无病生存期的影响分析

2.4 潜在假阳性结果的校正 多次检验和小样本量可能导致假阳性结果，本研究采用半贝叶斯收缩对病例进行校正，在采用先验假设［先验HR=1.000，95%CI：0.250~4.000）］的前提下，经半贝叶斯收缩，在显性模型下，与ABCC2 rs3740066野生基因型（CC型）比较，含次要等位基因T的基因型semi-BayesiancHR（95%CI）=2.171（0.828~5.692），P=0.115；semi-BayesianaHR（95%CI）=2.070（0.786~5.457），P=0.141。关联差异无统计学意义。

3 讨论

本研究探索了药代动力学相关基因多态性对食管鳞癌术后DFS的影响，结果显示，在食管鳞癌根治术后的患者中，显性基因模型下ABCC2 rs3740066含次要等位基因的基因型与DFS 缩短有关，而未发现临床因素，如性别、年龄、烟酒史以及食管原发肿瘤位置及数量等与DFS有关。

3.1 ABC 转运蛋白家族与恶性肿瘤 在药物代谢中，ABC转运蛋白家族起到重要的作用，作为主动外排泵，其成员主动地将各种物质，包括氨基酸、多糖、肽、脂质、药物和毒素转运出细胞外。根据ATP结合域氨基酸序列的不同，ABC 转运蛋白家族可分为7个亚型，即ABCA~G，包括ABCB1（也称为多药耐药-1，MDR1）、ABCG2（乳腺癌耐药蛋白，BCRP）以及ABCC2（多药耐药相关蛋白-2，MRP2）等，均在多药耐药中发挥着重要的作用［6］。既往研究也多集中在这些基因与药物不良反应及疗效的相关性上［7-8］。另一方面，除药物代谢外，ABC转运体还可作为癌症患者预后的生物标志物。研究证实，在肿瘤干细胞中有多种ABC 转运体，如ABCG2 和ABCC2，这些转运体通过主动外排缺氧条件下产生的细胞毒性代谢物，保护肿瘤干细胞免受缺氧相关细胞损伤，延长肿瘤干细胞的存活期［9］。有文献报道ABC转运蛋白低表达与多种恶性肿瘤，如肝内胆管癌、前列腺癌、头颈鳞癌等患者预后差有关［10-12］。ABCC2 作为ABC转运家族的一员，在药物分布、代谢和清除以及胞外运输中发挥着重要的作用，相较于分化好的肿瘤，ABCC2 在组织学分级高、分化差的肿瘤中表达更高。

3.2 ABCC2 基因多态性与恶性肿瘤 ABCC2 基因的SNP 与肿瘤细胞的药物抵抗、化疗药物清除和相关毒性以及患者预后有关［13］。目前，有关食管鳞癌中该基因多态性与患者复发关系的研究少见，但在胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤患者中ABCC2 与疗效和预后相关。在胰腺导管腺癌中，ABCC2 基 因 多 态 性 包 括rs3740067、rs3740073、rs717620、rs2273697 等的次要等位基因与患者预后差显著相关［14］。乳腺癌中，纯合子野生型ABCC2 rs717620 可致外排蛋白表达增加，引起他莫昔芬活性代谢物在胞内和血浆水平的有效浓度降低，导致治疗失败和患者术后复发［15］。肺癌中，ABCC2等位基因变异与化疗药物诱导的毒性和生存期有关［16-17］。而在结直肠癌中，ABCC2 的表达与DFS 延长有关［18］。由于人种及肿瘤类型的差异，对于ABCC2 基因多态性的影响，各研究结论不一，但均证实了其在肿瘤中起到了关键的调节作用。本研究中的ABCC2 rs3740066与胰腺癌研究中的rs3740067处于高度连锁不平衡，rs3740066 为错义变异，可能影响ABCC2 的表达与功能。与胰腺癌研究结论相似，本研究发现该SNP 的次要等位基因与预后不良相关。有研究认为ABCC2 影响预后的机制之一是通过活性氧（ROS）的信号活动。ROS是肿瘤细胞存活和转移的关键调控因素，包括侵袭、黏附、血管生成和增殖［19］。手术诱发的炎症反应创造了富含ROS的环境，而ABCC2可能通过转运活性氧影响肿瘤细胞生存，但具体机制以及SNP 在其中发挥的作用仍需生物学实验探索及验证。

3.3 研究的局限性 由于笔者所在内科病区的术后辅助治疗患者较少，加之部分患者拒绝签署知情同意提供血液学样本，故本研究样本量较小，导致检验效能较低，因此可能会遗漏有统计学意义的关联。例如，本研究未发现选择的临床因素，如性别、年龄等与DFS 相关，而既往对临床因素的研究也缺乏统一的结论，因此可能由于临床因素并不影响无病生存，但也可能是由检验效能低所导致。此外，作为回顾性研究，本研究可能会受到如回忆偏倚、混杂偏倚、测量偏倚等的影响，从而影响研究结果。基于定义，需要控制的混杂偏倚指的是“时间上发生在自变量和因变量之前，并能同时影响自变量和因变量的因素”，而SNP作为胚系突变，受混杂因素影响不大，因此本研究仅对性别和年龄做了校正，对围手术期治疗及分期等未行控制。而其他偏倚对作为胚系突变的SNP 及相关研究结论影响则更小。第三，出于对假阳性的顾虑，本研究采用了半贝叶斯收缩，收缩后并未发现有统计学意义的关联。由于缺乏生物机

制研究，且流行病学证据有限，因此本研究选择了先验系数均值0、方差1.92的正态分布，即指数化后先验HR95%CI为1.000（0.250~4.000），该选择是主观的，可能影响研究结论的客观性。综上，虽然经过半贝叶斯收缩，未发现有统计学意义的结果，但并不能够得出“基因多态性与无病生存期不存在关联”的结论；相反，受小样本量及多次检验的影响，以及半贝叶斯结果的提示，强烈建议未来更多的基础研究和大样本研究加以验证。最后，由于缺乏相应的生物学机制研究，因此该研究的结论难以在功能层面上进行解释，也对未来生物机制研究提出了更高的要求。

Tab.4 The effect of SNPs on disease free survival表4 SNP对无病生存期的影响分析

综上所述，本研究发现药物代谢动力学基因ABCC2 rs3740066 与食管鳞癌术后患者无病生存相关。但由于缺乏生物学研究，ABCC2 rs3740066 在其中发挥作用的机制尚不清楚，因此在需要更大样本量研究证实的同时，也需要更多的基础实验加以验证。